Fosfatasa alcalina--HYJ238
Este kit emplea el principio del método de sándwich de doble anticuerpo para la detección cuantitativa de las concentraciones de pirofosfatasa inorgánica en muestras. La microplaca está pre-recubierta con anticuerpos anti-pirofosfatasa inorgánica. La pirofosfatasa inorgánica presente en la muestra se une a los anticuerpos inmovilizados en los pocillos. Posteriormente, se añade un anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP), que se une específicamente a la pirofosfatasa inorgánica en la muestra, formando un complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo marcado con enzima. Tras añadir la solución de sustrato TMB, la HRP cataliza el sustrato para producir un producto azul, que cambia a amarillo al añadir una solución de parada ácida. La intensidad de la coloración amarilla es directamente proporcional a la concentración de pirofosfatasa inorgánica en la muestra. La absorbancia (valor de DO) se mide a 450 nm utilizando un lector de microplacas, y la concentración de pirofosfatasa inorgánica en la muestra se calcula a partir de una curva estándar.
Componentes
| Componentes | 48T | 96T |
| Microplaca ELISA | 8×6 | 8×12 |
| Conjugado enzimático (100×) | 60 µL | 120 µL |
| Tampón de dilución | 15 ml | 30 ml |
| solución de sustrato TMB | 6 ml | 12 ml |
| Solución de parada | 3 ml | 6 ml |
| Tampón de lavado concentrado (10x) | 15 ml | 30 ml |
| Estándar (0,1 mg/ml) | 25 µL | 50 µL |
| Selladora de placas | 2 piezas | 4 piezas |
Almacenamiento
- El estándar (0,1 mg/mL) del kit debe conservarse entre -25 y -15 °C, mientras que los demás componentes deben almacenarse entre 2 y 8 °C. Para garantizar la estabilidad del almacenamiento, evite la exposición a la luz intensa. Su vida útil es de 12 meses.
- Para kits usados: Una vez abierta la microplaca, cubra los pocillos no utilizados con un sellador de placas y vuelva a colocarlos en la bolsa de aluminio que contiene el desecante. Cierre bien la bolsa de aluminio y guárdela a 2-8 °C lo antes posible después de su uso. Los demás reactivos también deben guardarse a 2-8 °C lo antes posible después de su uso.
Materiales necesarios pero no suministrados
- Lector de microplacas con filtro de 450 ± 10 nm (mejor si puede detectar a longitudes de onda de 450 y 650 nm).
- Agitador de microplacas.
Instrucciones
Antes de comenzar
1. Deje que todos los componentes del kit y las muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 ℃) antes de usarlos. Si no va a utilizar todo el kit de una sola vez, extraiga únicamente las tiras reactivas y los reactivos necesarios para el experimento en cuestión y deje el resto en las condiciones requeridas.
2. Tampón de lavado: diluya 30 ml de tampón de lavado concentrado 10× con 270 ml de agua desionizada o destilada para preparar 300 ml de tampón de lavado 1×.
3. Estándar: Diluya el concentrado estándar (0,1 mg/ml) con tampón de dilución a 4 ng/ml, 2 ng/ml, 1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 0,25 ng/ml, 0,125 ng/ml, 0,0625 ng/ml y 0 ng/ml. Recomendamos diluir los estándares según la siguiente tabla:
| No. | Final Con. (pg/μL) | Instrucciones de dilución | |
| búfer STE | Estándar | ||
| 1000 | 198 µL | 2 μL 0,1 mg/mL estándar | |
| A | 4 | 498 µL | 2 μL 1000 ng/mL |
| B | 2 | 250 µL | 250 μL de solución A |
| do | 1 | 250 µL | 250 μL de solución B |
| D | 0,5 | 250 µL | 250 μL de solución C |
| Y | 0,25 | 250 µL | 250 μL de solución D |
| F | 0,125 | 250 µL | 250 μL de solución E |
| GRAMO | 0,0625 | 250 µL | 250 μL de solución F |
| H | 0 | 250 µL | / |
4. Solución de trabajo del conjugado enzimático: antes de usar, centrifugue brevemente la solución madre. Dilúyala a la concentración de trabajo con tampón de dilución.
5. Sustancia TMB: Aspire la dosis necesaria de la solución con puntas esterilizadas y no vuelva a verter la solución residual en el vial. TMB
El sustrato es sensible a la luz, no exponga el sustrato TMB a la luz durante mucho tiempo.* 1 pmol de extremos de ADN es aproximadamente 1 µg de un plásmido de 3 kb.
**Tampón de reacción 10×: 500 mM Bis-Tris-Propano HCl (pH 6,0, 25 °C), 10 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2
1. Incubar a 37°C durante 30 minutos.
2. Detener la reacción mediante inactivación térmica a 70 °C durante 5 minutos.
Notas
- El sistema de reacción puede ampliarse o reducirse según las necesidades experimentales.
- La enzima es un dímero homólogo, y el peso molecular de su monómero es de 35 kDa.
- Es indispensable involucrar al Zn2+ en el proceso de reacción ya que es un Zn2+ o Mg2+ enzima dependiente.
- Por su seguridad, utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.