Premezcla de RT-qPCR SYBR Green de un solo paso HYA416

Componentes

*Los componentes ya incluyen mezcla de dNTP, Mg²⁺, tinte de referencia pasiva ROX, etc.

**El kit One Step SYBR Green RT-qPCR Premix contiene RTasa, inhibidor de RNasa y ADN polimerasa Taq en proporciones optimizadas.

Almacenamiento

Este producto debe almacenarse a -20 ℃ para su conservación a largo plazo y debe protegerse de la luz.

Instrucciones

1. qRT-PCR RreacciónSistema

En general, una concentración final de cebador de 0,2 μM en el sistema de reacción permite obtener un buen efecto de mejora. Si el rendimiento de la reacción es relativamente bajo, la concentración del cebador puede ajustarse dentro del rango de concentración final de 0,1 a 1,0 μM.

**La precisión de la cantidad final de plantilla añadida al establecer el sistema de reacción tendrá un gran impacto en los resultados cuantitativos. Por lo tanto, se recomienda añadir la plantilla al sistema de reacción posteriormente (por ejemplo, de 2 a 5 μL/muestra), lo que puede mejorar eficazmente la repetibilidad del experimento. Se recomienda utilizar una plantilla de ARN total de 1 pg a 1 μg.

2. qRT-PCR RPrograma de reacción

*Para plantillas con estructuras secundarias complejas o regiones con alto contenido de GC, la temperatura de transcripción inversa se puede aumentar a 55 °C o 60 °C, lo que ayuda a mejorar la eficiencia posterior; y el tiempo de transcripción inversa se puede extender a 15 minutos, lo que ayuda a aumentar el rendimiento de ADNc.

*Esta condición de predesnaturalización es adecuada para las reacciones existentes. Si la estructura del molde es compleja, el tiempo de predesnaturalización puede extenderse a 3 minutos para mejorar el efecto de predesnaturalización.

Técnico Información

1. Selección del diluyente para la plantilla: Puede utilizar agua libre de nucleasas comprada, agua tratada con DEPC o agua libre de nucleasas preparada en laboratorio para diluir la plantilla. La solución TE contiene EDTA, que inhibe la actividad de la enzima y no puede utilizarse como diluyente.

2. La mezcla de enzimas SYBR contiene una alta concentración de glicerol. Centrifugue brevemente antes de usar, recoja el contenido en el fondo del tubo de reacción y aspire suavemente con una pipeta. Mezcle bien y luego aspire con precisión.

3. Al diseñar los cebadores, la longitud recomendada del producto de PCR objetivo es de 80 a 150 pb. Los cebadores que no se hayan utilizado durante mucho tiempo deben someterse primero a una prueba de integridad mediante electroforesis PAGE para descartar la posibilidad de degradación.

4. Si el control negativo sin plantilla muestra una amplificación evidente, debe considerarse la contaminación del sistema de reacción y la contaminación por aerosoles en el entorno de preparación. Puede reemplazar el kit, el agua y los cebadores para repetir el experimento; el sistema de reacción debe prepararse en una mesa de trabajo ultralimpia para reducir la contaminación por aerosoles.

5. Cuando la curva de fusión tenga múltiples picos, considere la posibilidad de que la plantilla de ARN contenga contaminación genómica, amplificación no específica, dímeros de cebadores, etc.

6. Si necesita mejorar la especificidad de la amplificación, puede aumentar adecuadamente la temperatura de hibridación (aumentando 3 °C cada vez).

7. Si necesita mejorar la eficiencia de amplificación, puede extender el tiempo de extensión del programa estándar de dos pasos a 60 segundos o utilizar el programa de tres pasos. El programa de amplificación de dos pasos generalmente configura la adquisición de señal en la etapa de extensión de recocido a 60 °C; el programa de amplificación de tres pasos debe configurar la adquisición de señal en la etapa de extensión a 72 °C. La configuración del programa es la siguiente: