Desoxirribonucleasa I (DNasa I), grado GMP HYC116
La DNasa I es una endonucleasa que puede digerir ADN monocatenario y bicatenario para producir desoxinucleótidos simples u oligodesoxinucleótidos monocatenarios o bicatenarios. Puede hidrolizar el enlace fosfodiéster para producir monodesoxinucleótidos y oligodesoxinucleótidos que contienen grupos 5'-fosfato y grupos 3'-OH. El producto de digestión promedio es el politetranucleótido más pequeño. La DNasa I puede catalizar muchas formas de ADN, como ADN monocatenario, ADN bicatenario e incluso cromatina (su velocidad de corte se ve afectada por las histonas). El rango de pH óptimo es 7-8. La actividad de la DNasa I depende del Ca²⁺.+ y puede activarse mediante iones metálicos divalentes, como el Co2+, Mn²+, Zn²+, etc. 5 mM Ca²+ puede proteger la enzima de ser hidrolizada. En presencia de Mg²+, la enzima puede reconocer y cortar cualquier sitio en cualquier hebra de ADN de forma aleatoria; y en presencia de Mn²+Este sistema puede reconocer dos hebras de ADN simultáneamente y cortarlas prácticamente en el mismo punto, generando extremos romos o extremos cohesivos con 1 o 2 nucleótidos sobresalientes. El producto se elabora conforme a las normas GMP y se suministra en forma líquida.
Componentes
| Componentes | 500 U | 2000 EN | 10000 U |
| Desoxirribonucleasa I (DNasa I), grado GMP | 250 μL | 1 ml | 5 ml |
Almacenamiento
Almacenar a -15 °C ~ -25 °C durante un año.
Definición de unidad
Cantidad de enzima necesaria para degradar completamente 1 μg de ADN plasmídico en 10 min a 37 ℃. (El tampón de reacción es: 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 2,5 mM MgCl2,0,5 mM CaCl₂, 1 μg de ADN plasmídico)
Especificación
| Fuente | Recombinante E. colicon el gen DNasa I |
| Temperatura óptima | 37℃ |
| búfer de almacenamiento | 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM CaCl2, 50% (v/v) Glicerol |
Instrucciones
1. Digestión de la plantilla de plásmido
1) Sistema de reacción:
Utilice el tubo de centrífuga y la punta de pipeta libres de RNasa para preparar el siguiente sistema de reacción:
| Componentes | Volumen |
| Tampón DNasa I 10×* | 1 μL |
| DNasa I | 1 μL |
| ARN | incógnita |
| ddH₂O libre de RNasa | Hasta 10 μL |
*Tampón 10×DNasa I: 10 mM Tris-HCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, pH 7,6 a 25℃.
2) Condiciones de reacción:
A 37 °C, entre 15 y 30 minutos después, añadir una solución de EDTA de concentración final de 2,5 mM y mezclar bien a 65 °C durante 10 minutos. La plantilla procesada puede utilizarse en reacciones posteriores, como la reacción de recubrimiento.
2. Inactivación o inhibición de la DNasa I
Tras añadir EDTA hasta una concentración final de 2,5 mM, calentar a 65 ℃ durante 10 minutos puede inactivar la DNasa I. La extracción con fenol y cloroformo también puede inactivarla. Las siguientes condiciones tienen un efecto inhibidor significativo sobre la DNasa I: agentes quelantes de iones metálicos, iones de zinc con una concentración de milimoles/litro, SDS al 0,1 %, DTT, mercaptoetanol y otros agentes reductores, y concentraciones de sal superiores a 50-100 mM.
Aplicaciones
Preparación de ARN libre de ADN; Eliminación del ADN molde después de la transcripción in vitro; Preparación de ARN libre de ADN antes de las reacciones de RT-PCR y RT-qPCR; Combinación con ADN polimerasa I para realizar el marcaje de ADN mediante translocación de muescas; Construcción de bibliotecas de fragmentación de ADN.
Notas
1. Las enzimas deben almacenarse en una nevera portátil o en un baño de hielo cuando se utilicen, y deben almacenarse a -20 ℃ inmediatamente después de su uso.
2. Para su seguridad y salud, utilice equipo de protección personal (EPP), como batas de laboratorio y guantes desechables, al manipular este producto.