Polimerasa de poli(A) de E. coli - HYJ233
La poli(A) polimerasa cataliza la adición de AMP, convertido a partir de ATP, al extremo 3' del ARN de manera independiente de la plantilla.
Componentes
| Componentes | 100 U | 500 U |
| Polimerasa de E. coli poli(A) (5000 U/mL) | 20 μL | 100 μL |
| Tampón de reacción de polimerasa (poli(A)) 10X | 1,5 ml | 1,5 ml |
| ATP (10 mM) | 200 μL | 200 μL |
Almacenamiento
Almacenar a -20°C.
búfer de almacenamiento
20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 50% glicerol, 0,1% (p/v) Triton® X-100, pH 7,5 a 25 °C
Fuente
Derivada de una cepa de Escherichia coli que porta el gen de la poli(A) polimerasa clonado de E. coli.
Definición de actividad
Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la incorporación de 1 nmol de AMP en el ARN en 10 minutos a 37 °C en una mezcla de reacción de 20 µl.
Aplicaciones
- Marcaje del ARN con ATP o cordicepina.
- Adición de colas de poli(A) al ARN para clonación o purificación por afinidad.
- Aumentar la estabilidad del ARNm para mejorar la eficiencia de la traducción en células eucariotas después de la transfección.
Inhibición e inactivación
Inactivar a 80 °C durante 15 minutos.
Instrucción
1. Añada los siguientes componentes de reacción en hielo según la tabla que aparece a continuación (ejemplo para un volumen de reacción de 20 μL):
| Componentes | Volumen |
| Tampón de reacción de polimerasa (poli(A)) 10X | 2 μL |
| ATP (10 mM) | 2 μL |
| Polimerasa de poli(A) de E. coli | 1 μL |
| ARN (1-10 μg) | 10 μL |
| ddH2EL | Hasta 20 μL |
2. Mezcle bien todos los componentes de la reacción y centrifugue brevemente para recoger la solución en el fondo del tubo.
3. Incubar a 37 °C durante 30 minutos.
4. Inactivar por calor incubando a 85 °C durante 15 minutos o añadir EDTA hasta una concentración final de 10 mM.
5. Se puede agregar un inhibidor de ARNasa para mejorar la estabilidad del ARN en la solución, con una concentración 1X de 1 U/μL.