Kit de análisis del tamaño del ADN residual de E. coli-HYI162

Componentes y almacenamiento

Reactivo	Cantidad	Almacenamiento
Tampón de reacción de qPCR	850 µL x 8 tubos	-20℃ proteger de la luz
Mezcla de sondas y cebadores para E. coli MIX-85	300 µL x 1 tubo
Mezcla de sondas y cebadores para E. coli MIX-103	300 µL x 1 tubo
Mezcla de sondas y cebadores para E. coli MIX-220	300 µL x 1 tubo
Mezcla de sondas y cebadores para E. coli MIX-550	300 µL x 1 tubo
Mezcla IPC	550 µL x 1 tubo
Control del ADN de E. coli	50 µL x 1 tubo	-20℃
Tampón de dilución de ADN (DDB)	1,5 mL × 3 tubos

Los componentes del kit pueden almacenarse en condiciones adecuadas durante un máximo de 24 meses. Por favor, compruebe la fecha de caducidad en las etiquetas.

Instrumentos aplicados, incluidos, entre otros, los siguientes:

• Sistema de PCR en tiempo real 7500
• Sistema de PCR en tiempo real CFX96
• Sistema de PCR en tiempo real Lightcycler480

Materiales necesarios no incluidos en el kit.

• Tubos de microcentrífuga antiadherentes, libres de DNasa y de baja retención, 1,5 ml
• Puntas antiadherentes de baja retención, 1000 μL, 100 μL, 10 μL
• Placas de qPCR de 96 pocillos o tubos de PCR de 8 tiras

Equipos relacionados

• Sistema de PCR en tiempo real
• Mezclador de vórtice
• agitador de microplacas
• Pipetas, 1000μL, 100μL, 10μL
• agitador de microplacas

Flujo de trabajo

Instrucciones

1. Preparación del experimento

1.1 Utilice gafas protectoras, mascarilla, ropa y guantes adecuados.

1.2 Irradie la mesa, las pipetas y los tubos con luz ultravioleta durante 30 minutos y desinfecte con etanol al 75%.

1.3 Descongele el kit completamente a 2-8°C o derrítalo sobre hielo.

2. Diluciones seriadas de control de ADN para la curva estándar.

Nota: El kit contiene cuatro mezclas de cebadores y sondas de E. coli para diferentes longitudes de fragmento. Configure cuatro curvas estándar independientes, una para cada longitud de fragmento.

Por favor, compruebe la concentración indicada en la etiqueta del tubo que contiene el control de ADN de E. coli antes de la dilución.

Prepare cuatro conjuntos de solución de control de ADN de E. coli con tampón de dilución de ADN (DDB) siguiendo el procedimiento de dilución en serie que se describe a continuación:

2.1 Descongele completamente el ADN de control de E. coli y el DDB a 2-8 °C o derrítalos en hielo. Agite en vórtex para mezclar bien y centrifugue rápidamente los reactivos durante 3-5 segundos en una microcentrífuga, y repita 3 veces.

2.2 Etiquete seis tubos de microcentrífuga antiadherentes de 1,5 mL: ST0, ST1, ST2, ST3, ST4 y ST5.

2.3 Diluya el control de ADN a 3000 pg/μL con DDB en el tubo ST0. Agite en vórtex para mezclar bien y centrifugue rápidamente los reactivos durante 3-5 segundos en una microcentrífuga, y repita 3 veces para mezclar completamente.

2.4 Añada 180 μL de DDB a cada tubo de ST1, ST2, ST3, ST4 y ST5.

2.5 Realice las diluciones en serie según la Tabla 2:

Tabla 2. Dilución para E. coli Control del ADN

Tubo de dilución en serie	Dilución	Concentración (pg/μL)
ST0	Diluya el control de ADN con DDB.	3000
ST1	20 μL ST0 + 180 μL DDB	300
ST2	20 μL ST1 + 180 μL DDB	30
ST3	20 μL ST2 + 180 μL DDB	3
ST4	20 μL ST3 + 180 μL DDB	0,3
ST5	20 μL ST4 + 180 μL DDB	0,03

• El DDB restante sin usar debe almacenarse a 2-8 °C. Si la solución está turbia o contiene precipitados, caliéntela a 37 °C hasta que se aclare.
• Se deben incluir al menos cinco concentraciones de la curva estándar. Para seleccionar las diluciones de muestra adecuadas, recomendamos realizar la validación del método antes de analizar las muestras.

3. Preparación de la muestra

Agregue 100 μL de DDB a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y etiquételo como NCS. Las muestras NCS y las muestras deben prepararse de la misma manera para la extracción de ADN.

4. Preparación de la mezcla para qPCR

4.1 Determinar el número de pocillos de reacción basándose en la curva estándar, con el número de muestras de prueba y muestras de control. Generalmente, se realizan pruebas por triplicado para cada muestra. Número de pocillos de reacción = (curva estándar de 5 gradientes de concentración + 1 NTC + 1 NCS + muestras de prueba) × 3

4.2 Prepare la mezcla de qPCR por separado según la Tabla 3 - 6.

Tabla 3. Preparación de la mezcla qPCR MIX-85

Reactivos	Volumen/reacción	Volumen para 30 reacciones(incluye un 10% de recargo)
Tampón de reacción de qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mezcla de sondas y cebadores para E. coli MIX-85	2,8 μL	92,4 μL
Mezcla IPC	1,3 μL	42,9 μL
Volumen total	20 μL	660 μL

Tabla 4. Preparación de la mezcla qPCR MIX-103

Reactivos	Volumen/reacción	Volumen para 30 reacciones (incluye un 10% de recargo)
Tampón de reacción de qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mezcla de sondas y cebadores para E. coli MIX-103	2,8 μL	92,4 μL
Mezcla IPC	1,3 μL	42,9 μL
Volumen total	20 μL	660 μL

Tabla 5. Preparación de la mezcla qPCR MIX-220

Reactivos	Volumen/reacción	Volumen para 30 reacciones (incluye un 10% de recargo)
Tampón de reacción de qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mezcla de sondas y cebadores para E. coli MIX-220	2,8 μL	92,4 μL
Mezcla IPC	1,3 μL	42,9 μL
Volumen total	20 μL	660 μL

Tabla 6. Preparación de la mezcla qPCR MIX-550

Reactivos	Volumen/reacción	Volumen para 30 reacciones (incluye un 10% de recargo)
Tampón de reacción de qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mezcla de sondas y cebadores para E. coli MIX-550	2,8 μL	92,4 μL
Mezcla IPC	1,3 μL	42,9 μL
Volumen total	20 μL	660 μL

Para la detección simultánea de los cuatro fragmentos, prepare al menos 120 μL de ADN molde para cuatro ensayos. Recomendamos preparar dos tubos de cada muestra para el pretratamiento simultáneo y mezclarlos después de la extracción.

4.3 Después de mezclar completamente la mezcla qPCR MIX, divida 20 μL de cada tubo en tubos de PCR de 8 tiras o en una placa de qPCR de 96 pocillos.

5. Preparación de la mezcla de reacción de qPCR

5.1 Prepare la mezcla de reacción de qPCR de acuerdo con la Tabla 7-10 y el diseño de la placa de 96 pocillos como se muestra en la Tabla 11.

Tabla 7. Preparación de la mezcla de reacción qPCR MIX-85

Tubos	Curva estándar-85	NTC	NCS	Muestra de prueba
qPCR MIX-85	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Muestras	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purificado	10 μL de muestra de prueba purificada
Volumen total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tabla 8. Preparación de la mezcla de reacción qPCR MIX-103

Tubos	Curva estándar-103	NTC	NCS	Muestra de prueba
qPCR MIX-103	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Muestras	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purificado	10 μL de muestra de prueba purificada
Volumen total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tabla 9. Preparación de la mezcla de reacción qPCR MIX-220

Tubos	Curva estándar-220	NTC	NCS	Muestra de prueba
qPCR MIX-220	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Muestras	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purificado	10 μL de muestra de prueba purificada
Volumen total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tabla 10. Preparación de la mezcla de reacción qPCR MIX-550

Tubos	Curva estándar-550	NTC	NCS	Muestra de prueba
qPCR MIX-550	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Muestras	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purificado	10 μL de muestra de prueba purificada
Volumen total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tabla 11. Ejemplo de disposición de una placa de 96 pocillos.

MEZCLA-95

MEZCLA-103

MEZCLA-220

MEZCLA-550

A

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

B

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

do

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

D

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

Y

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

F

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

GRAMO

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

H

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

• Este ejemplo representa cuatro ensayos, que incluyen puntos seleccionados de la curva estándar de ADN de E. coli Control (ST1-ST5), 1 NTC, 1 NCS y 1 muestra de prueba, con 3 réplicas para cada muestra.
• La disposición de la placa para la carga de muestras se puede ajustar en función de la cantidad de muestras.

5.2 Selle la placa de 96 pocillos con una película selladora. Mezcle bien en un agitador de microplacas, luego centrifugue los reactivos durante 10 segundos en una microcentrífuga y colóquela en el instrumento de qPCR.

6. Configuración del programa qPCR

NOTA: Las siguientes instrucciones se aplican únicamente al instrumento ABI7500 con SDS v1.4. Si utiliza un instrumento o software diferente, consulte la documentación correspondiente.

6.1 Cree un nuevo documento y, a continuación, en la lista desplegable Ensayo, seleccione Curva estándar (Cuantificación absoluta).

6.2 Clic Nuevo detector, luego ingrese E.coli-85 en el campo Nombre, seleccione FAMILIA en la lista desplegable Tinte Reporter y seleccione (ninguno) en la lista desplegable Quencher Dye, luego haga clic DE ACUERDO.

6.3 Cree un nuevo detector para E.coli-103, E.coli-220 y E.coli-550, por separado como en el paso 2.

6.4 Clic Nuevo detectorLuego, ingrese IPC en el campo Nombre. Seleccione VIC en la lista desplegable Tinte Reporter y seleccione (ninguno) en la lista desplegable Quencher Dye, luego haga clic DE ACUERDO.

6.5 Seleccionar ROX como tinte de referencia pasivo, luego haga clic Próximo.

6.6 Seleccione el conjunto de pozos aplicable para las muestras y, a continuación, seleccione el detector correspondiente para cada pozo.

6.7 Seleccione Acabado y, a continuación, configure las condiciones del ciclo térmico:

6.7.1 Ajuste el volumen de reacción del ciclo térmico a 30 μL.

6.7.2 Establezca la temperatura y el tiempo como se indica en la Tabla 12:

Tabla 12. Temperatura y tiempo de ejecución de la qPCR.

Paso	Temperatura.	Tiempo (mm:seg)	Ciclos
Activación	95℃	10:00	1
Desnaturalización	95℃	00:15	40
Recocido	60℃	00:30
Extensión	72℃*	01:30

*El instrumento leerá la señal de fluorescencia durante este paso.

6.8 Guarde el documento y luego haga clic. Comenzar para iniciar la ejecución de qPCR en tiempo real.

7. Análisis de resultados

7.1 Seleccionar Configuración En la pestaña, configure las tareas para cada tipo de muestra haciendo clic en la lista desplegable de la columna de tareas:

7.1.1 NTC: tarea del detector de ADN objetivo = NTC

7.1.2 NCS, muestras de prueba = Desconocido

7.2 Establezca la curva estándar como se muestra en la siguiente tabla:

Tabla 13. Configuración de la curva estándar

Etiqueta del tubo	Tarea	Cantidad (pg/μL)
ST1	Estándar	300
ST2	Estándar	30
ST3	Estándar	3
ST4	Estándar	0,3
ST5	Estándar	0,03

7.3 Seleccione el Resultados pestaña, luego seleccione Gráfico de amplificación.

7.4 En la lista desplegable Datos, seleccione Delta Rn vs Ciclo.

7.5 En la ventana Configuración de análisis, introduzca la siguiente configuración:

7.5.1 Seleccionar Tomografía computarizada manual.

7.5.2 En el campo Umbral, introduzca 0,02.

7.5.3 Seleccionar Línea base automática.

7.6 Haz clic en el botón de la barra de herramientas y espera a que finalice el análisis de la placa.

7.7 Seleccione el Resultado pestaña>>Curva estándar pestaña, luego verifique la pendiente, la intersección y R² valores.

7.8 Seleccione la pestaña Informe y, a continuación, obtenga la cantidad media y la desviación estándar para cada muestra.

7.9 Seleccionar Archivo > > Exportar > > ResultadosEn la lista desplegable Guardar como tipo, seleccione Exportar archivos de resultados, luego haga clic Ahorrar.

Nota: La configuración de los parámetros del análisis de resultados debe basarse en el modelo específico y la versión del software, y generalmente también puede ser interpretada automáticamente por el instrumento.

7.10 Establezca el valor del tamaño del ADN-85 en 100%, calcule el porcentaje del tamaño del ADN de 103, 220 y 550.

7.11 Analice el valor Ct de IPC. Normalmente, el valor medio de Ct-IPC de la muestra debe estar dentro de ±1,0 del valor Ct-IPC del NCS. Si el valor medio de Ct-IPC de la muestra es significativamente mayor que el valor Ct-IPC del NCS, esto indica que la muestra podría ser inhibidora del ensayo. Recomendamos analizar las muestras ERC en el mismo ensayo y tomar como criterio el resultado de la tasa de recuperación de la muestra.

7.12 El valor Ct de NTC y NCS debe ser mayor que el valor Ct medio de la concentración más baja de la curva estándar o no se muestran picos significativos en la curva de amplificación, mientras que realiza una curva de amplificación normal en el canal de señal VIC.