Premezcla FastAmpli Probe RT-qPCR plus-UNG HYA432
detalles del producto
FastAmpli Probe RT-qPCR Premix plus-UNG es un reactivo especializado para la detección cuantitativa fluorescente (mediante sonda TaqMan) de la amplificación de ARN. Contiene una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa de amplificación rápida, modificadas genéticamente y seleccionadas, lo que permite completar las reacciones de PCR en 20-40 minutos. Este producto presenta una alta tolerancia a los inhibidores, una mayor eficiencia de transcripción inversa y amplificación por PCR, lo que lo hace adecuado para la amplificación de alta sensibilidad de plantillas de ARN de baja concentración. Genera excelentes curvas estándar en un amplio rango de cuantificación, lo que garantiza una cuantificación precisa. Formulado con una mezcla de enzima de amplificación resistente a la inhibición y enzima UNG, junto con un sistema de tampón optimizado que contiene dUTP, este reactivo no solo logra una amplificación eficiente de los genes diana en muestras con inhibidores, sino que también previene eficazmente las reacciones falsas positivas causadas por el arrastre de productos de PCR y la contaminación por aerosoles. Es compatible con los instrumentos de PCR en tiempo real de la mayoría de los fabricantes, incluidos Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad y Roche.
Componentes
1. Mezcla 10×FastAmpli RTase/UNG
2. 5×FastAmpli RT Premix Buffer (dUTP) (Mg2+gratis)
3. 25×MgCl2
Almacenamiento
Conservar a -20 ℃ para su almacenamiento a largo plazo; se mantiene estable durante 3 meses a 4 ℃. Mezclar bien antes de usar y evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Instrucciones
1. Sistema de reacción
| Componentes | 25 µL Volumen | 50 µL Volumen | Concentración final |
| 5×FastAmpli RT Premix Buffer (dUTP) (Mg2+gratis) | 5 µL | 10 µL | 1× |
| Mezcla FastAmpli RTasa/UNG 10× | 2,5 µL | 5 µL | 1× |
| 25×MgCl2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mezcla de cebadores y sondas 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN molde** | - | - | - |
| DEPC H2EL | Hasta 25 µL | Hasta 50 µL | - |
*Al utilizar protocolos de PCR convencionales para la amplificación, una concentración final de cebadores de 0,2 μM suele dar resultados satisfactorios; si el rendimiento de la reacción no es satisfactorio, la concentración de cebadores se puede ajustar en el rango de 0,2 a 1 μM. Generalmente, la concentración de sonda se optimiza en el rango de 0,1 a 0,3 μM. Se pueden realizar experimentos de gradiente de concentración para identificar la combinación óptima de cebadores y sondas. Al utilizar protocolos de PCR rápidos para la amplificación, aumentar adecuadamente las concentraciones de cebadores y sondas puede dar mejores resultados de amplificación, y la proporción cebador-sonda debe optimizarse.
**El número de copias del gen diana varía según el tipo de plantilla. Si es necesario, se puede realizar una dilución en serie para determinar la cantidad óptima de plantilla a añadir.
2. Programa de reacción
| PCR regular programa | |||
| Spaso | Ttemperatura | Tiempo | Ciclos |
| Transcripción inversa | 50℃ | 10-20 minutos | 1 |
| desnaturalización inicial | 95℃ | 1-5 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Recocido y extensión | 56~64℃ | 20-60 s | |
| RputaPCR programa | |||
| Spaso | Ttemperatura | Tiempo | Ciclos |
| Transcripción inversa | 50℃ | 5 minutos | 1 |
| desnaturalización inicial | 95℃ | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 1-3 s | 40-50 |
| Recocido y extensión | 56~64℃ | 3-20 s | |
Control de calidad
1. Pruebas funcionales: sensibilidad, especificidad y repetibilidad de la qRT-PCR.
2. Libre de actividad nucleasa extraña, así como de contaminación por endonucleasas y exonucleasas extrañas.
Información técnicainformación
1. La tasa de amplificación de la ADN polimerasa rápida contenida en este producto es de al menos 1 kb/10 s. Existen variaciones significativas en la velocidad de rampa de temperatura, el modo de control de temperatura y la eficiencia de transferencia de calor entre los diferentes equipos de PCR rápida. Se recomienda optimizar los parámetros de reacción óptimos en función del equipo de PCR rápida específico utilizado.
2. El tiempo de transcripción inversa debe optimizarse en función de la longitud de los fragmentos objetivo; se recomienda un tiempo de transcripción inversa suficientemente prolongado para fragmentos más largos.
3. La temperatura de hibridación-extensión debe optimizarse de acuerdo con los valores de Tm de los cebadores y las sondas, así como con las condiciones reales de reacción.
4. Para cebadores con bajas temperaturas de hibridación o para la amplificación de fragmentos largos que superen los 200 pb, se recomienda el protocolo de PCR de tres pasos.
5. Los distintos genes diana varían en su eficiencia de utilización de dUTP y en su sensibilidad a la enzima UNG. Por lo tanto, si el uso del sistema UNG reduce la sensibilidad de detección, el sistema de reacción debe ajustarse y optimizarse en consecuencia. Para obtener asistencia técnica, póngase en contacto con nuestra empresa.
6. Utilice áreas y pipetas específicas para las etapas previas y posteriores a la amplificación. Trabaje con guantes y cámbielos con frecuencia. No abra los tubos de reacción una vez finalizada la PCR para minimizar la contaminación de las muestras con los amplicones de la PCR.
7. ¡Solo para fines de investigación!