Premezcla FastDirect Probe qPCR plus-UNG HYA424
FastDirect Probe qPCR Premix plus-UNG es un reactivo especializado diseñado para la detección directa de amplificación cuantitativa de ADN (mediante sonda) de genes diana, eliminando la necesidad de extracción y purificación de ácidos nucleicos de las muestras. Contiene una ADN polimerasa de amplificación rápida, modificada genéticamente y seleccionada, que permite completar las reacciones de PCR en 30 minutos. Este producto presenta una alta tolerancia a los inhibidores, lo que permite la detección directa de la amplificación de ADN en muestras como sangre entera anticoagulada, plasma, suero y frotis faríngeos, sin necesidad de extracción ni purificación previa del ADN. Además, gracias a su formulación con un tampón optimizado específico para qPCR y un sistema anticontaminación UNG/dUTP, este reactivo previene eficazmente la amplificación falsamente positiva causada por el arrastre de productos de PCR y la contaminación por aerosoles.
Componentes
2×FastDirect Probe qPCR Premix plus-UNG
*Este reactivo contiene enzima de arranque en caliente, UNG, tampón PCR, MgCl2, dNTPs, estabilizador y otros ingredientes.
Almacenamiento
Conservar a -20 ℃ para su almacenamiento a largo plazo; se mantiene estable durante 3 meses a 4 ℃. Mezclar bien antes de usar y evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Instrucción
1. Sistema de reacción
| Componentes | Sistema de 25 µL | Sistema de 50 µL |
| 2×FastDirect Probe qPCR Premix plus-UNG | 12,5 µL | 25 µL |
| Mezcla de cebadores y sondas 25×* | 1 µL | 2 μL |
| ADN molde** | -- | -- |
| ddH2EL | Hasta 25 µL | Hasta 50 µL |
*Al utilizar protocolos de PCR convencionales para la amplificación, una concentración final de cebadores de 0,2 μM suele proporcionar resultados satisfactorios. Si el rendimiento de la reacción no es satisfactorio, la concentración de cebadores se puede ajustar dentro del rango de 0,2 a 1 μM. Generalmente, la concentración de sonda se puede optimizar dentro del rango de 0,1 a 0,3 μM. Se pueden realizar experimentos de gradiente de concentración para identificar la combinación óptima de cebadores y sondas. Al utilizar protocolos de PCR rápida para la amplificación, aumentar adecuadamente las concentraciones de cebadores y sondas puede producir mejores resultados de amplificación, y la proporción cebador-sonda debe optimizarse.
**Los tipos, el contenido de inhibidores y el número de copias de genes diana varían entre los diferentes tipos de muestras biológicas; asimismo, existen variaciones en el impacto de los distintos tipos de soluciones de conservación de muestras (por ejemplo, soluciones de conservación de hisopos) en los resultados de la amplificación. Por lo tanto, el volumen óptimo de muestra en el sistema de reacción debe determinarse en función de las condiciones reales, como el tipo de muestra y los requisitos de sensibilidad de detección. Si es necesario, la muestra puede diluirse con agua libre de nucleasas o tampón TE antes de añadirla al sistema de reacción. Los volúmenes de muestra recomendados son los siguientes:
| Muestra | Sistema de 50 µL | Relación de carga máxima |
| Sangre entera | 2,5 µL | 5% |
| Plasma | 10 µL | 30% |
| Suero | 5 µL | 10% |
| Hisopado de garganta | 2,5 µL | 5% |
2. Rprograma de reacción
| Programa general de PCR | |||
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Digestión | 50 ℃ | 2 minutos | 1 |
| Arranque en caliente | 95℃ | 1-5 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95℃ | 10-20 s | 40-50 |
| recocido y extensión | 56-64 ℃ | 20-60 s | |
| Rápidoprograma PCR | |||
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Digestión | 50 ℃ | 2 minutos | 1 |
| Arranque en caliente | 95℃ | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 95℃ | 1-3 s | 40-45 |
| recocido y extensión | 56-64 ℃ | 3-20 s | |
Control de calidad
1. Pruebas funcionales: sensibilidad, especificidad y repetibilidad de la qPCR.
2. Libre de actividad nucleasa extraña, así como de contaminación por endonucleasas y exonucleasas extrañas.
Descripción técnica
1. La tasa de amplificación de la ADN polimerasa rápida contenida en este producto es de al menos 1 kb/10 s. Existen variaciones significativas en la velocidad de rampa de temperatura, el modo de control de temperatura y la eficiencia de transferencia de calor entre los diferentes termocicladores. Al utilizar este reactivo, se deben explorar los parámetros de reacción óptimos para el termociclador rápido específico que se utilice.
2. Si se presentan problemas como valores bajos de fluorescencia o una inhibición significativa de la amplificación, se recomienda reducir el volumen de la muestra o diluirla antes de agregarla al sistema de reacción; alternativamente, el problema puede mejorarse aumentando el volumen de reacción (60–100 µL) manteniendo el volumen de la muestra sin cambios.
3. La toma de muestras como sangre y frotis faríngeos mencionados anteriormente se realizará de acuerdo con los procedimientos operativos estándar (POE) clínicos; para evitar la degradación de los ácidos nucleicos, se recomienda utilizar muestras recién tomadas.
4. Para cebadores con bajas temperaturas de hibridación o para la amplificación de fragmentos largos que superen los 200 pb, se recomienda el protocolo de PCR de tres pasos.
5. Los distintos genes diana varían en su eficiencia de utilización de dUTP y en su sensibilidad a la enzima UNG. Por lo tanto, si el uso del sistema UNG reduce la sensibilidad de detección, el sistema de reacción debe ajustarse y optimizarse en consecuencia.
6. Utilice áreas y pipetas específicas para las etapas previas y posteriores a la amplificación. Trabaje con guantes y cámbielos con frecuencia. No abra los tubos de reacción una vez finalizada la PCR para minimizar la contaminación de las muestras con los amplicones de la PCR.
7. ¡Solo para fines de investigación!