Kit de preparación de bibliotecas de ADN Fast Tagment para Illumina (para 50 ng) HYD122
El kit de preparación de bibliotecas de ADN Fast Tagment para Illumina (para 50 ng) es un kit de construcción de bibliotecas basado en transposasa desarrollado especialmente para Illumina.®Plataforma de secuenciación de alto rendimiento. Es adecuada para la construcción de 50 ng de ADN genómico, ADNc, amplicones (>500 pb) y otras muestras. En comparación con la construcción de bibliotecas convencional paso a paso, el kit Fast Tagment DNA Library Prep para Illumina utiliza una nueva transposasa y un sistema de tampón optimizado para completar la fragmentación del ADN, la reparación de extremos y la ligación de adaptadores en solo 10 minutos, reduciendo significativamente el tiempo de construcción de la biblioteca a menos de 1,5 horas y logrando una excelente calidad de secuenciación. Además, este kit ha sido verificado para muestras de ADN con diferentes contenidos de GC, sin preferencia o con una preferencia muy baja. Todos los componentes de este kit han sido sometidos a una estricta verificación de calidad y funcionalidad para garantizar el excelente rendimiento del producto y la máxima estabilidad entre lotes.
Componentes
| Componentes | 24T | 96T |
| Tampón de reacción 5× | 240 μL | 960 μL |
| Mezcla de transposomas V50 | 120 μL | 480 μL |
| Solución de terminación 6× | 240 μL | 960 μL |
| Mezcla de cebadores de PCR | 72 μL | 288 μL |
| 2× Mezcla de amplificación Ultima | 600 μL | 2400 μL |
| T5 (T501)* | - | - |
| T7 (T701)* | - | - |
| T7 (T702)* | - | - |
*Secuencia de índice durante la secuenciación: T501-CTCTCTAT (NovaSeq 6000 v1.0) o ATAGAGAG (NovaSeq 6000 v1.5), T701-TAAGGCGA, T702-CGTACTAG.
Condiciones de almacenamiento
Almacenar a -25~-15℃ durante 1 año.
Notas
Acerca de la operación
1. Por su seguridad, utilice batas de laboratorio y guantes desechables.
2. Descongele los componentes a temperatura ambiente. Una vez descongelados, mézclelos bien agitando en un vórtex, gire brevemente el tubo y colóquelos en hielo para su uso posterior.
3. Al preparar la solución de reacción de cada paso, se recomienda usar una pipeta para mezclar bien o agitar suavemente. Una agitación vigorosa puede provocar una disminución en el rendimiento de la biblioteca.
4. Se recomienda encarecidamente utilizar puntas de pipeta con filtro para evitar la contaminación cruzada. Asegúrese de cambiar las puntas de pipeta al procesar diferentes muestras.
5. Las operaciones incorrectas pueden causar contaminación por aerosoles, lo que afecta la precisión del resultado. Se recomienda el aislamiento físico obligatorio de las regiones de mezcla de la reacción de PCR y las regiones del ensayo de purificación del producto de PCR. Equipado con equipos como pipetas especializadas para la preparación de bibliotecas. Realice una limpieza rutinaria de cada área limpiando las superficies con hipoclorito de sodio al 0,5 % o lejía al 10 %.
6. Este producto es solo para uso en investigación.
Acerca del principio del producto
Este producto se desarrolla mediante el método de transposasa, cuyo principio fundamental es la transposasa y su mecanismo de transposición. La mezcla de transposomas contiene un transposón completo compuesto por transposasa y dos adaptadores equimolares, el Adaptador 1 y el Adaptador 2. Durante la transposición, el transposón inserta las secuencias de los adaptadores 1 y 2 en el gen diana, formando una molécula de ADN con el Adaptador 1 en un extremo y el Adaptador 2 en el otro. Posteriormente, se utiliza una ADN polimerasa para rellenar la incisión resultante. Este producto se amplifica mediante dos pares de cebadores: N5 (N5XX) y N7 (N7XX), y P5 y P7 (mezcla de cebadores para PCR). Tras la clasificación y purificación, el producto se convierte en una biblioteca secuenciable.
Fragmentación del ADN
1. Este kit utiliza transposasa para la fragmentación del ADN. Si la muestra de ADN es un producto de PCR, su longitud debe ser superior a 500 pb. Dado que la transposasa no actúa sobre los extremos del ADN, la cobertura de secuenciación de los últimos 50 pb del producto de PCR puede verse reducida. Recomendamos extender los extremos de la región a analizar entre 50 y 100 pb al preparar el producto de PCR para evitar la reducción de la cobertura de secuenciación terminal.
2. Este kit es adecuado para 1 ng de ADN de entrada. Antes de añadir el ADN de entrada, este debe purificarse y disolverse en agua destilada estéril (A260/A280 = 1,8-2,0) y cuantificarse mediante métodos basados en colorantes fluorescentes para ADN de doble cadena, como Qubit®, PicoGreen®, etc. Nota: Dado que la mezcla de transposomas es muy sensible a la concentración de ADN, la determinación precisa de dicha concentración es crucial para el éxito del experimento.
Purificación de ADN y selección de tamaño mediante microesferas.
1. Las perlas magnéticas deben equilibrarse a temperatura ambiente antes de su uso; de lo contrario, el rendimiento disminuirá y el efecto de selección de tamaño se verá afectado.
2. Las perlas magnéticas deben mezclarse bien mediante agitación en vórtex o pipeteo antes de su uso.
3. No aspire las perlas al transferir el sobrenadante, ya que incluso cantidades mínimas de las perlas pueden afectar las reacciones posteriores.
4. El etanol al 80% debe prepararse en el momento, de lo contrario afectará la eficiencia de recuperación.
5. Para una selección precisa del tamaño, se recomienda comenzar con un volumen superior a 100 μL. Si el volumen es menor, se recomienda completarlo hasta 100 μL con agua ultrapura.
6. Las perlas magnéticas deben secarse a temperatura ambiente antes de la elución del producto. Un secado insuficiente puede provocar que el etanol residual afecte las reacciones posteriores; un secado excesivo puede causar que las perlas magnéticas se agrieten y reducir el rendimiento de la purificación. Normalmente, un secado a temperatura ambiente de 3 a 5 minutos es suficiente para que las perlas se sequen completamente.
7. Si es necesario, las muestras de ADN purificadas o seleccionadas por tamaño, eluidas en tampón TE 0,1×, pueden almacenarse a 4 °C durante 1-2 semanas o a -20 °C durante un mes.
Amplificación de biblioteca
1. El paso de amplificación de la biblioteca es necesario al usar este kit. Dado que el producto de la reacción de transposición no es una biblioteca completa de ADN de doble cadena, se debe generar una biblioteca completa de ADN mediante una reacción de PCR.
2. Cuando la cantidad de ADN de entrada es de 50 ng, se recomiendan de 5 a 9 ciclos de amplificación, y la biblioteca obtenida tras 7 ciclos tiene un volumen aproximado de 900 ng.
Análisis de la calidad de la biblioteca
1. La calidad de las bibliotecas construidas se analiza generalmente midiendo las concentraciones y las distribuciones de tamaño.
2. Las concentraciones de las bibliotecas se pueden medir mediante métodos basados en fluorescencia, como Qubit.®y PicoGreen®o
3. NO se recomienda utilizar métodos de cuantificación basados en la absorbancia, como NanoDrop.®.
4. Se recomienda utilizar el método qPCR para la cuantificación de la biblioteca: métodos basados en fluorescencia como Qubit.®y PicoGreen®No se pueden diferenciar las estructuras de ADN bicatenario incompletas (insertos sin adaptador o con solo uno de los extremos ligado a un adaptador) de las bibliotecas completas. El método de qPCR solo amplifica y mide las bibliotecas completas con ambos extremos ligados a adaptadores (las bibliotecas secuenciables), lo que proporciona una medición más precisa de la carga.
5. La distribución del tamaño de las bibliotecas se puede analizar utilizando Agilent Bioanalyzer u otros dispositivos basados en los principios de electroforesis capilar o microfluídica.
Otro Materiales
1. Perlas magnéticas para purificación de ADN: Perlas de selección de ADN NGS o perlas AMPure XP u otros productos equivalentes.
2. Análisis de la calidad de la biblioteca: Bioanalizador Agilent Technologies 2100 u otros productos equivalentes.
3. Cebadores de índice N5 (N5XX) y N7 (N7XX): Kit de índice de fragmentos NGS para Illumina.
4. Otros materiales: etanol absoluto, agua ultrapura estéril, tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0-8,5 + 1 mM EDTA), puntas de pipeta de baja retención, tubo de PCR, soportes magnéticos, termociclador, etc.