Premezcla de sonda qPCR RobuDirect plus-UNG HYA425
RobuDirect Probe qPCR Premix plus-UNG es un reactivo especializado diseñado para la detección de amplificación de ADN cuantitativa por fluorescencia directa (basada en sondas) de genes diana, eliminando la necesidad de extracción y purificación de ácidos nucleicos de las muestras. Presenta una alta tolerancia a los inhibidores, lo que permite la detección de amplificación de ADN directa a partir de muestras como sangre entera anticoagulada, plasma, suero, hisopos faríngeos y saliva, sin extracción ni purificación previa de ácidos nucleicos. Formulado con una mezcla de enzima de amplificación resistente a la inhibición y enzima UNG, junto con un sistema de tampón optimizado que contiene dUTP, este reactivo no solo logra una amplificación eficiente de los genes diana en muestras con inhibidores, sino que también previene eficazmente las reacciones falsas positivas causadas por el arrastre de productos de PCR y la contaminación por aerosoles.
Componentes
2×RobuDirect Probe qPCR Premix plus-UNG
*Este reactivo contiene enzima de arranque en caliente, UNG, tampón PCR, MgCl2, dNTPs, estabilizador y otros ingredientes.
Almacenamiento
Conservar a -20 ℃ para su almacenamiento a largo plazo; se mantiene estable durante 3 meses a 4 ℃. Mezclar bien antes de usar y evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Instrucción
1. Sistema de reacción
| Componentes | Sistema de 25 µL | Sistema de 50 µL |
| 2×RobuDirect Probe qPCR Premix plus-UNG | 12,5 µL | 25 µL |
| Mezcla de cebadores y sondas 25×* | 1 µL | 2 μL |
| ADN molde** | -- | -- |
| ddH2EL | Hasta 25 µL | Hasta 50 µL |
Por lo general, una concentración final de cebador de 0,2 μM proporciona resultados satisfactorios; si el rendimiento de la reacción no es satisfactorio, la concentración de cebador se puede ajustar dentro del rango de 0,2 a 1 μM. Generalmente, la concentración de sonda se optimiza dentro del rango de 0,1 a 0,3 μM. Se pueden realizar experimentos de gradiente de concentración para identificar la combinación óptima de cebadores y sondas.
**Los tipos, el contenido de inhibidores y el número de copias de genes diana varían entre los diferentes tipos de muestras biológicas; asimismo, existen variaciones en el impacto de los distintos tipos de soluciones de conservación de muestras (por ejemplo, soluciones de conservación de hisopos) en las reacciones de amplificación. Por lo tanto, el volumen óptimo de muestra en el sistema de reacción debe determinarse en función de las condiciones reales, como el tipo de muestra y los requisitos de sensibilidad de detección. Si es necesario, la muestra puede diluirse con agua libre de nucleasas o tampón TE antes de añadirla al sistema de reacción. Los volúmenes de muestra recomendados son los siguientes:
| Muestra | Sistema de 50 µL | Relación de carga máxima |
| sangre entera | 2,5 µL | 5% |
| Plasma | 10 µL | 30% |
| Suero | 10 µL | 30% |
| Hisopado de garganta | 10 µL | 30% |
2. Rprograma de reacción
| Programa general de PCR | |||
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Digestión | 50 ℃ | 2 minutos | 1 |
| Arranque en caliente | 95℃ | 1-5 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95℃ | 10-20 s | 40-50 |
| recocido y extensión | 56-64 ℃ | 20-60 s | |
Control de calidad
1. Pruebas funcionales: sensibilidad, especificidad y repetibilidad de la qPCR.
2. Libre de actividad nucleasa extraña, así como de contaminación por endonucleasas y exonucleasas extrañas.
Descripción técnica
1. El RobuDirect Probe qPCR Premix plus-UNG cuenta con un inicio en caliente de 1 a 5 minutos y es compatible con reacciones de PCR multiplex en tiempo real basadas en sondas.
2. Si se presentan problemas como valores bajos de fluorescencia o una inhibición significativa de la amplificación, se recomienda reducir el volumen de la muestra o diluirla antes de agregarla al sistema de reacción; alternativamente, el problema puede mejorarse aumentando el volumen de reacción (60–100 µL) manteniendo el volumen de la muestra sin cambios.
3. La toma de muestras como sangre y frotis faríngeos mencionados anteriormente se realizará de acuerdo con los procedimientos operativos estándar (POE) clínicos; para evitar la degradación de los ácidos nucleicos, se recomienda utilizar muestras recién tomadas.
4. Para cebadores con bajas temperaturas de hibridación o para la amplificación de fragmentos largos que superen los 200 pb, se recomienda el protocolo de PCR de tres pasos.
5. Los distintos genes diana varían en su eficiencia de utilización de dUTP y en su sensibilidad a la enzima UNG. Por lo tanto, si el uso del sistema UNG reduce la sensibilidad de detección, el sistema de reacción debe ajustarse y optimizarse en consecuencia.
6. Utilice áreas y pipetas específicas para las etapas previas y posteriores a la amplificación. Trabaje con guantes y cámbielos con frecuencia. No abra los tubos de reacción una vez finalizada la PCR para minimizar la contaminación de las muestras con los amplicones de la PCR.
7. ¡Solo para fines de investigación!