Premezcla para RT-qPCR multiplex de un solo paso - UNG M2 HYA437
detalles del producto
Multiplex One Step RT-qPCR Premix-UNG M2 es un reactivo específico para reacciones cualitativas y cuantitativas mediante el método de sonda fluorescente RT-PCR de un solo paso en amplificación multiplex. La reacción completa se realiza de forma continua en un solo tubo sin necesidad de abrirlo, lo que previene eficazmente la contaminación. Este producto contiene una transcriptasa inversa termoestable con actividad RNasa H eliminada y una ADN polimerasa Taq de arranque en caliente modificada genéticamente, lo que proporciona una eficiencia superior de transcripción inversa y amplificación por PCR. Es adecuado para la amplificación de alta sensibilidad de plantillas de ARN de baja concentración. Formulado con un tampón específico para qPCR optimizado y el sistema de prevención de contaminación UNG/dUTP, el reactivo produce una curva estándar de alta calidad en un amplio rango de cuantificación para una cuantificación precisa. También inhibe eficazmente la amplificación falsamente positiva causada por productos de PCR residuales y contaminación por aerosoles. Este reactivo es compatible con instrumentos de qPCR fluorescente en tiempo real de la mayoría de los fabricantes, incluidos Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad y Roche.
Componentes
1. Mezcla múltiple 20× RTase/UNG
2. 8×RT Premix Multi Buffer (dUTP) (Mg2+gratis)
3. 360 mM MgCl2
Almacenamiento
Conservar a -20 ℃ para su almacenamiento a largo plazo. Se mantiene estable durante 3 meses a 4 ℃. Mezclar bien antes de usar. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Instrucciones
1. Preparación del sistema de reacción qRT-PCR
| Componentes | Volumen de 25 µL | Volumen de 50 µL | Concentración final |
| 8×RT Premix Multi Buffer (dUTP) (Mg2+gratis) | 3,125 µL | 6,25 µL | 1× |
| Mezcla múltiple 20× RTasa/UNG | 1,25 µL | 2,5 µL | 1× |
| 360 mM MgCl2 | 0,417 µL | 0,833 µL | 6 mM |
| Mezcla de cebadores y sondas 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN molde** | — | — | — |
| ddH2EL | A 25 µL | A 50 µL | — |
Una concentración final de cebadores de 0,2 μM suele proporcionar resultados óptimos. Si el rendimiento de la reacción es subóptimo, ajuste la concentración de cebadores dentro del rango de 0,2 a 1 μM. La concentración de sonda se optimiza generalmente entre 0,1 y 0,3 μM. Se pueden realizar experimentos de gradiente de concentración para identificar la combinación óptima de cebadores y sondas.
**El número de copias del gen diana varía según el tipo de plantilla de ARN. Si es necesario, se puede realizar una dilución en serie para determinar la cantidad óptima de plantilla de ARN que se debe añadir.
2. Programa de reacción
| Programa de PCR regular | |||
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Transcripción inversa | 50℃ | 10-20 minutos | 1 |
| Predesnaturalización | 95℃ | 1-5 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Recocido y extensión | 56~64℃ | 20-60 s | |
Control de calidad
1. Pruebas funcionales: sensibilidad, especificidad y repetibilidad de la qRT-PCR.
2. Libre de actividad nucleasa extraña, así como de contaminación por endonucleasas y exonucleasas extrañas.
Información técnica
1. Este sistema contiene la enzima TS-UNG, que puede degradar plantillas de ADN que contienen uracilo a temperatura ambiente (TA) o a 25 ℃, y se inactiva durante la transcripción inversa, por lo que no afecta la posterior amplificación por PCR utilizando ADNc como plantilla.
2. La reacción de transcripción inversa para este sistema se realiza normalmente a 50 °C. La temperatura de transcripción inversa se puede optimizar en el rango de 42 a 55 °C; dependiendo de las características de la reacción, el tiempo de transcripción inversa se puede optimizar entre 5 y 30 minutos.
3. La transcriptasa inversa (RTasa) empleada en este sistema está modificada genéticamente a partir de M-MLV, lo que le confiere una mayor tolerancia a la temperatura y una temperatura de retrotranscripción más elevada. Esto se traduce en una eficiencia de retrotranscripción superior para plantillas de ARN con estructuras complejas.
4. Este sistema ofrece una excelente estabilidad y aplicabilidad, lo que lo hace idóneo para la detección de plantillas complejas como el ARN viral y el ARN extraído de tejidos. Proporciona un rendimiento de amplificación más estable para plantillas de concentración extremadamente baja y es adecuado para su uso en reactivos de diagnóstico molecular de alta sensibilidad.
5. Para cebadores con una temperatura de hibridación baja o para la amplificación de fragmentos largos que superen los 200 pb, se recomienda el protocolo de PCR de tres pasos.
6. Los distintos genes diana varían en su eficiencia de utilización de dUTP y en su sensibilidad a la enzima UNG. Por lo tanto, si el uso del sistema UNG reduce la sensibilidad de detección, se debe ajustar y optimizar el sistema de reacción.
7. Utilice áreas y pipetas exclusivas antes y después de la amplificación. Trabaje con guantes y cámbielos con frecuencia. No abra los tubos de reacción una vez finalizada la PCR para minimizar la contaminación de las muestras con los productos de la PCR.
8. ¡Solo para fines de investigación!