Kit de análisis del tamaño del ADN residual HEK293-HYI163

Componentes y almacenamiento

Reactivo	Cantidad	Almacenamiento
Tampón de reacción de qPCR	850 µL x 8 tubos	-20℃ proteger de la luz
Mezcla de cebadores y sondas HEK293-75	300 µL x 1 tubo
HEK293 Cebador y sonda MIX-122	300 µL x 1 tubo
Mezcla de cebadores y sondas HEK293 MIX-244	300 µL x 1 tubo
HEK293 Cebador y sonda MIX-562	300 µL x 1 tubo
Mezcla IPC	550 µL x 1 tubo
Control de ADN de HEK293	50 µL x 1 tubo	-20℃
Tampón de dilución de ADN (DDB)	1,5 mL × 3 tubos

Los componentes del kit pueden almacenarse en condiciones adecuadas durante un máximo de 24 meses. Por favor, compruebe la fecha de caducidad en las etiquetas.

Instrumentos aplicados, incluidos, entre otros, los siguientes:

• Sistema de PCR en tiempo real 7500
• Sistema de PCR en tiempo real CFX96
• Sistema de PCR en tiempo real Lightcycler480

Materiales necesarios no incluidos en el kit.

• Tubos de microcentrífuga antiadherentes, libres de DNasa y de baja retención, 1,5 ml
• Puntas antiadherentes de baja retención, 1000 μL, 100 μL, 10 μL
• Placas de qPCR de 96 pocillos o tubos de PCR de 8 tiras

Equipos relacionados

• Sistema de PCR en tiempo real
• Mezclador de vórtice
• agitador de microplacas
• Pipetas, 1000μL, 100μL, 10μL
• agitador de microplacas

Flujo de trabajo

Instrucciones

1. Preparación del experimento

1.1 Utilice gafas protectoras, mascarilla, ropa y guantes adecuados.

1.2 Irradie la mesa, las pipetas y los tubos con luz ultravioleta durante 30 minutos y desinfecte con etanol al 75%.

1.3 Descongele el kit completamente a 2-8°C o derrítalo sobre hielo.

2. Diluciones seriadas de control de ADN para la curva estándar.

Nota: El kit contiene cuatro mezclas de cebadores y sondas HEK293 para diferentes longitudes de fragmento. Configure cuatro curvas estándar independientes, una para cada longitud de fragmento.

Por favor, compruebe la concentración que figura en la etiqueta del tubo que contiene el control de ADN HEK293 antes de la dilución.

Prepare cuatro conjuntos de solución de control de ADN HEK293 con tampón de dilución de ADN (DDB) siguiendo el procedimiento de dilución en serie que se describe a continuación:

2.1 Descongele completamente el ADN de control HEK293 y el DDB a 2-8 °C o derrítalos en hielo. Agite en vórtex para mezclar bien y centrifugue rápidamente los reactivos durante 3-5 segundos en una microcentrífuga, y repita 3 veces.

2.2 Etiquete seis tubos de microcentrífuga antiadherentes de 1,5 mL: ST0, ST1, ST2, ST3, ST4 y ST5.

2.3 Diluya el control de ADN a 3000 pg/μL con DDB en el tubo ST0. Agite en vórtex para mezclar bien y centrifugue rápidamente los reactivos durante 3-5 segundos en una microcentrífuga, y repita 3 veces para mezclar completamente.

2.4 Añada 180 μL de DDB a cada tubo de ST1, ST2, ST3, ST4 y ST5.

2.5 Realice las diluciones en serie según la Tabla 2:

Tabla 2. Dilución para el control de ADN HEK293

Tubo de dilución en serie	Dilución	Concentración (pg/μL)
ST0	Diluya el control de ADN con DDB.	3000
ST1	20 μL ST0 + 180 μL DDB	300
ST2	20 μL ST1 + 180 μL DDB	30
ST3	20 μL ST2 + 180 μL DDB	3
ST4	20 μL ST3 + 180 μL DDB	0,3
ST5	20 μL ST4 + 180 μL DDB	0,03

• El DDB restante sin usar debe almacenarse a 2-8 °C. Si la solución está turbia o contiene precipitados, caliéntela a 37 °C hasta que se aclare.
• Se deben incluir al menos cinco concentraciones de la curva estándar. Para seleccionar las diluciones de muestra adecuadas, recomendamos realizar la validación del método antes de analizar las muestras.

3. Preparación de la muestra

Agregue 100 μL de DDB a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y etiquételo como NCS. Las muestras NCS y las muestras deben prepararse de la misma manera para la extracción de ADN.

4. Preparación de la mezcla para qPCR

4.1 Determinar el número de pocillos de reacción basándose en la curva estándar, con el número de muestras de prueba y muestras de control. Generalmente, se realizan pruebas por triplicado para cada muestra. Número de pocillos de reacción = (curva estándar de 5 gradientes de concentración + 1 NTC + 1 NCS + muestras de prueba) × 3

4.2 Prepare la mezcla de qPCR por separado según la Tabla 3 - 6.

Tabla 3. Preparación de la mezcla qPCR MIX-75

Reactivos	Volumen/reacción	Volumen para 30 reacciones(incluye un 10% de recargo)
Tampón de reacción de qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mezcla de cebadores y sondas HEK293-75	2,8 μL	92,4 μL
Mezcla IPC	1,3 μL	42,9 μL
Volumen total	20 μL	660 μL

Tabla 4. Preparación de la mezcla qPCR MIX-122

Reactivos	Volumen/reacción	Volumen para 30 reacciones(incluye un 10% de recargo)
Tampón de reacción de qPCR	15,9 μL	524,7 μL
HEK293 Cebador y sonda MIX-122	2,8 μL	92,4 μL
Mezcla IPC	1,3 μL	42,9 μL
Volumen total	20 μL	660 μL

Tabla 5. Preparación de la mezcla qPCR MIX-244

Reactivos	Volumen/reacción	Volumen para 30 reacciones(incluye un 10% de recargo)
Tampón de reacción de qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mezcla de cebadores y sondas HEK293 MIX-244	2,8 μL	92,4 μL
Mezcla IPC	1,3 μL	42,9 μL
Volumen total	20 μL	660 μL

Tabla 6. Preparación de la mezcla qPCR MIX-562

Reactivos	Volumen/reacción	Volumen para 30 reacciones(incluye un 10% de recargo)
Tampón de reacción de qPCR	15,9 μL	524,7 μL
HEK293 Cebador y sonda MIX-562	2,8 μL	92,4 μL
Mezcla IPC	1,3 μL	42,9 μL
Volumen total	20 μL	660 μL

Para la detección simultánea de los cuatro fragmentos, prepare al menos 120 μL de ADN molde para cuatro ensayos.

4.3 Después de mezclar completamente la mezcla qPCR MIX, divida 20 μL de cada tubo en tubos de PCR de 8 tiras o en una placa de qPCR de 96 pocillos.

5. Preparación de la mezcla de reacción de qPCR

5.1 Prepare la mezcla de reacción de qPCR de acuerdo con la Tabla 7-10 y el diseño de la placa de 96 pocillos como se muestra en la Tabla 11.

Tabla 7. Preparación de la mezcla de reacción qPCR MIX-85

ST-75	20 μL de qPCR MIX-75 + 10 μL de ST1/ST2/ST3/ST4/ST5
NTC	20 μL de qPCR MIX-75 + 10 μL de DDB
NCS	20 μL de qPCR MIX-75 + 10 μL de NCS purificado
Muestra de prueba	20 μL de qPCR MIX-75 + 10 μL de muestra de prueba purificada

Tabla 8. Preparación de la mezcla de reacción qPCR MIX-122

ST-122	20 μL de qPCR MIX-122 + 10 μL de ST1/ST2/ST3/ST4/ST5
NTC	20 μL de qPCR MIX-122 + 10 μL de DDB
NCS	20 μL de qPCR MIX-122 + 10 μL de NCS purificado
Muestra de prueba	20 μL de qPCR MIX-122 + 10 μL de muestra de prueba purificada

Tabla 9. Preparación de la mezcla de reacción qPCR MIX-244

ST-244	20 μL de qPCR MIX-244 + 10 μL de ST1/ST2/ST3/ST4/ST5
NTC	20 μL de qPCR MIX-244 + 10 μL de DDB
NCS	20 μL de qPCR MIX-244 + 10 μL de NCS purificado
Muestra de prueba	20 μL de qPCR MIX-244 + 10 μL de muestra de prueba purificada

Tabla 10. Preparación de la mezcla de reacción qPCR MIX-562

ST-562	20 μL de qPCR MIX-562 + 10 μL de ST1/ST2/ST3/ST4/ST5
NTC	20 μL de qPCR MIX-562 + 10 μL de DDB
NCS	20 μL de qPCR MIX-562 + 10 μL de NCS purificado
Muestra de prueba	20 μL de qPCR MIX-562 + 10 μL de muestra de prueba purificada

Tabla 11. Ejemplo de disposición de una placa de 96 pocillos.

MEZCLA-75

MEZCLA-122

MEZCLA-244

MEZCLA-562

A

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

B

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

do

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

D

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

Y

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

F

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

GRAMO

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

H

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

• Este ejemplo representa cuatro ensayos, que incluyen puntos seleccionados de la curva estándar de control de ADN HEK293 (ST1-ST5), 1 NTC, 1 NCS y 1 muestra de prueba, con 3 réplicas para cada muestra.
• La disposición de la placa para la carga de muestras se puede ajustar en función de la cantidad de muestras.

5.2 Selle la placa de 96 pocillos con una película selladora. Mezcle bien en un agitador de microplacas, luego centrifugue los reactivos durante 10 segundos en una microcentrífuga y colóquela en el instrumento de qPCR.

6. Configuración del programa qPCR

NOTA: Las siguientes instrucciones se aplican únicamente al instrumento ABI7500 con SDS v1.4. Si utiliza un instrumento o software diferente, consulte la documentación correspondiente.

6.1 Cree un nuevo documento y, a continuación, en la lista desplegable Ensayo, seleccione Curva estándar (Cuantificación absoluta).

6.2 Clic Nuevo detector, luego ingrese HEK293-75 en el campo Nombre, seleccione FAMILIA en la lista desplegable Tinte Reporter y seleccione (ninguno) en la lista desplegable Quencher Dye, luego haga clic DE ACUERDO.

6.3 Cree un nuevo detector para HEK293-122, HEK293-244 y HEK293-562, por separado como en el paso 2.

6.4 Clic Nuevo detectorLuego, ingrese IPC en el campo Nombre. Seleccione VIC en la lista desplegable Tinte Reporter y seleccione (ninguno) en la lista desplegable Quencher Dye, luego haga clic DE ACUERDO.

6.5 Seleccionar ROX como tinte de referencia pasivo, luego haga clic Próximo.

6.6 Seleccione el conjunto de pozos aplicable para las muestras y, a continuación, seleccione el detector correspondiente para cada pozo.

6.7 Seleccione Acabado y, a continuación, configure las condiciones del ciclo térmico:

6.7.1 Ajuste el volumen de reacción del ciclo térmico a 30 μL.

6.7.2 Establezca la temperatura y el tiempo como se indica en la Tabla 12:

Tabla 12. Temperatura y tiempo de ejecución de la qPCR.

Paso	Temperatura.	Tiempo (mm:seg)	Ciclos
Activación	95℃	10:00	1
Desnaturalización	95℃	00:15	40
Recocido	60℃	00:30
Extensión	72℃*	01:30

*El instrumento leerá la señal de fluorescencia durante este paso.

6.8 Guarde el documento y luego haga clic. Comenzar para iniciar la ejecución de qPCR en tiempo real.

7. Análisis de resultados

7.1 Seleccionar Configuración En la pestaña, configure las tareas para cada tipo de muestra haciendo clic en la lista desplegable de la columna de tareas:

1) NTC: tarea del detector de ADN objetivo = NTC

2) NCS, muestras de prueba = Desconocido

7.2 Establezca la curva estándar como se muestra en la siguiente tabla:

Tabla 13. Configuración de la curva estándar

Etiqueta del tubo	Tarea	Cantidad (pg/μL)
ST1	Estándar	300
ST2	Estándar	30
ST3	Estándar	3
ST4	Estándar	0,3
ST5	Estándar	0,03

7.3 Seleccione el Resultados pestaña, luego seleccione Gráfico de amplificación.

7.4 En la lista desplegable Datos, seleccione Delta Rn vs Ciclo.

7.5 En la ventana Configuración de análisis, introduzca la siguiente configuración:

1) Seleccionar Tomografía computarizada manual.

2) En el campo Umbral, introduzca 0,02.

3) Seleccionar Línea base automática.

7.6 Haz clic en el botón de la barra de herramientas y espera a que finalice el análisis de la placa.

7.7 Seleccione el Resultado pestaña>>Curva estándar pestaña, luego verifique la pendiente, la intersección y R² valores.

7.8 Seleccione la pestaña Informe y, a continuación, obtenga la cantidad media y la desviación estándar para cada muestra.

7.9 Seleccionar Archivo > > Exportar > > ResultadosEn la lista desplegable Guardar como tipo, seleccione Exportar archivos de resultados, luego haga clic Ahorrar.

7.10 Establezca el tamaño del ADN de 75 como 100%, calcule el porcentaje del tamaño del ADN de 122, 244 y 562.

7.11 Analizar el valor Ct de IPC. Normalmente, el valor Ct-IPC de la muestra debe estar dentro de ±1,0 del valor Ct-IPC del NCS. Si el valor Ct-IPC de la muestra es significativamente mayor que el del NCS, indica que la muestra podría estar inhibida. Se recomienda analizar las muestras de ERC simultáneamente y tomar como criterio el resultado de la tasa de recuperación de la muestra.

7.12 El valor Ct de NTC y NCS debe ser mayor que el valor Ct medio de la concentración más baja en la curva estándar.

Nota: La configuración de los parámetros del análisis de resultados debe basarse en el modelo específico y la versión del software, y generalmente también puede ser interpretada automáticamente por el instrumento.