Transcriptasa inversa M-MLV (sin glicerol) HYA213
Este producto se deriva del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV), una ADN polimerasa dependiente de ARN que carece de actividad exonucleasa 3'→5' y cuya actividad RNasa H se ha eliminado por mutación. Esta enzima es una nueva transcriptasa inversa obtenida mediante múltiples mutaciones puntuales a partir de M-MLV (RNasa H-). Puede soportar una temperatura de reacción de 50 °C y utilizarse para la transcripción inversa de plantillas de ARN con estructuras secundarias que mejoran la afinidad con la plantilla. Este producto puede utilizarse para la síntesis de ADNc de primera y segunda cadena, la extensión de cebadores de ARN, RT-PCR, RT-qPCR y la construcción de bibliotecas de ADNc.
Componentes
| Componente | 10 KU | 100 KU | 2000 KU |
| Transcriptasa inversa M-MLV 200 U/μL (sin glicerol) | 0,05 mL | 0,5 mL | 10 ml |
| 5×Tampón de transcriptasa inversa | 0,5 mL | 5 ml | 10×10 mL |
Almacenamiento
Almacenar entre -25°C y -15°C.
Definición de unidad
Una unidad de actividad (U) se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 nmol de dTTP en sustancias insolubles en ácido a 37 °C durante 10 min utilizando Poly (rA)·Oligo (dT) como plantilla/cebador.
Control de calidad
1. Pureza de la proteína(SDS-PAGE): ≥95%;
2. Residuo de endonucleasa: 200 U de este producto y 1 μg de λDNA reaccionaron a 37℃ durante 16 horas, y la banda electroforética del ADN no cambió;
3. Residuo de exonucleasa: 200 U de este producto y 1 μg de ADN digerido con λ-HindIII reaccionaron a 37℃ durante 16 horas, y la banda electroforética del ADN no cambió;
4. Residuo de RNasa: 200 U de este producto y 1,6 μg de MS2RNA reaccionaron a 37℃ durante 4 horas, y la banda electroforética del ARN no cambió;
5. E. coli residuo del genoma: El ácido nucleico residual en 600 U de este producto se detectó mediante qPCR TaqMan específica paraE. coliEl ADNr 16S y el E. coli El residuo del genoma era inferior a 10 copias;
Instrucciones
1. Sistema de reacción
| Componentes | Volumen |
| ARN molde* | opcional |
| Oligo(dT)18 (50 µM) o mezcla de cebadores aleatorios (50 ng/µL) | 1 μL |
| Mezcla de dNTP (10 mM de cada uno) | 1 μL |
| Inhibidor de la ARNasa (40 U/µL) | 1 μL |
| Transcriptasa inversa M-MLV 200 U/μL (sin glicerol) | 1 μL |
| 5×Tampón de transcriptasa inversa | 4 μL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 20 μL |
*La cantidad de ARN molde añadido se puede consultar en la siguiente tabla.
| ARN total | 10 pg~5 μg |
| ARN poli(A) | 10 pg~500 ng |
2. Reacción Programa
| Temperatura | Tiempo |
| 25 °C* | 5 minutos |
| 50 °C** | 45 minutos*** |
| 85 °C | 2 minutos |
*Si utiliza Random Primer Mix, añada este paso de incubación; omita este paso cuando utilice Oligo(dT).18o cebador específico del gen.
**Si la plantilla tiene una estructura secundaria compleja o una región GC alta, la temperatura de reacción se puede aumentar a 55℃ para ayudar a aumentar el rendimiento.
***Prolongar el tiempo de transcripción inversa puede ayudar a obtener ADNc más largo (>5 kb).
Notas
1. Para evitar la contaminación por RNasa, mantenga limpia el área experimental y utilice guantes y mascarillas limpios durante el procedimiento. Los materiales consumibles, como tubos de centrífuga y puntas de pipeta, utilizados en el experimento deben estar libres de RNasa.
2. Los productos de ADNc se pueden almacenar a -20℃ o -80℃ o utilizarse inmediatamente para reacciones de PCR (qPCR).
3. Se recomienda que el volumen de productos de ADNc utilizados para las reacciones de PCR (qPCR) no supere 1/10 del volumen de la reacción de PCR.