Transcriptasa inversa M-MLV M2 HYA212
La transcriptasa inversa M-MLV M2 se obtuvo mediante la selección de mutaciones del gen M-MLV del virus de la leucemia murina de Moloney y su expresión en E. coli. Esta enzima carece de actividad RNasa H y presenta una mayor tolerancia a la temperatura. Es idónea para la transcripción inversa a altas temperaturas, lo que contribuye a eliminar los efectos adversos de la estructura de alto nivel del ARN y los factores inespecíficos en la síntesis de ADNc. Posee mayor estabilidad y capacidad de síntesis por transcripción inversa.
Componentes
1. 200 U/µL de transcriptasa inversa M-MLV M2
2. Tampón de transcriptasa inversa 5×M-MLV (opcional)
*El tampón de transcriptasa inversa 5×M-MLV no contiene dNTPs. Añada dNTPs al preparar el sistema de reacción.
Almacenamiento
Almacenar entre -25°C y -15°C.
Definición de unidad
Una unidad de actividad (U) se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 nmol de dTTP en sustancias insolubles en ácido a 37 °C durante 10 min utilizando Poly (rA)·Oligo (dT) como plantilla/cebador.
Control de calidad
1. Pureza >98% determinada mediante electroforesis SDS-PAGE.
2. Sensibilidad de amplificación, variación entre lotes y estabilidad.
3. Libre de actividad nucleasa exógena; sin contaminación por endonucleasas o exonucleasas exógenas.
Instrucciones
1. Consulte la tabla a continuación para preparar el sistema.
| Componentes | Volumen |
| ARN molde | ARN total ≤ 5 µg; ARNm ≤ 1 µg |
| Oligo(dT)12-18 Primer* | 50 pmol |
| OPrimer aleatorio * | 50 pmol (20~100 pmol) |
| OCebador específico del gen * | 2 pmol |
| dNTPs (10 mM cada uno) | 1 μL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 10 μL |
*Elija diferentes tipos de cebadores según las necesidades experimentales.
2. Calentar a 65℃ durante 5 minutos y enfriar rápidamente sobre hielo durante 2 minutos;
3. Añada los siguientes componentes al sistema anterior hasta alcanzar un volumen total de 20 µL y mezcle suavemente.
| Componentes | Volumen |
| Tampón de transcriptasa inversa 5×M-MLV | 4 µL |
| 200 U/µL Transcriptasa inversa M-MLV M2 | 1 µL |
| Inhibidor de RNasa 40 U/µL | 1 µL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 20 μL |
4. Realice la reacción bajo las siguientes condiciones.
1) Si se utiliza Random Primer, incubar primero a 25℃ durante 10 min; luego incubar a 50℃ durante 30~60 min;
2) Si se utiliza Oligo dT o cebadores específicos, incubar a 50℃ durante 30~60 min.
5. Inactive la transcriptasa inversa M-MLV calentándola a 95℃ durante 5 minutos y detenga la reacción.
6. El producto de transcripción inversa se puede utilizar directamente para la reacción de PCR y la reacción de PCR cuantitativa por fluorescencia, o almacenarse a -20℃ durante un largo período de tiempo.
Descripción técnica
1. Adecuado para la optimización de la temperatura de transcripción inversa en el rango de 42℃~55℃.
2. Gracias a su mayor estabilidad, es adecuado para la amplificación por transcripción inversa a alta temperatura, lo que facilita su paso eficaz a través de la compleja estructura del ARN y resulta idóneo para la detección mediante RT-PCR cuantitativa por fluorescencia multiplex en un solo paso.
3. Presenta buena compatibilidad con diversas enzimas de amplificación por PCR y es adecuado para reacciones de RT-PCR de alta sensibilidad.
4. Es adecuado para reacciones de RT-PCR cuantitativa por fluorescencia de un solo paso y alta sensibilidad, mejorando eficazmente la tasa de detección de plantillas de baja concentración.
5. Es adecuado para la construcción de bibliotecas de ADNc.
6. Carrera de 3' y 5'.