ARNm Cap2'-O-Metiltransferasa--HYJ232
La mRNA Cap 2´-O-metiltransferasa (mRNA Cap 2´-O-metiltransferasa) se deriva de una cepa recombinante de Escherichia coli que porta el gen de la mRNA Cap 2´-O-metiltransferasa del virus vaccinia. Esta enzima añade un grupo metilo a la posición 2´-O del primer nucleótido inmediatamente anterior a la estructura cap en el extremo 5´ del ARN. También puede metilar el ARN con cap (Cap 0) utilizando S-adenosilmetionina (SAM) como donador de metilo, formando así una estructura Cap 1. La estructura Cap 1 mejora la eficiencia de la traducción del ARNm y, por lo tanto, puede ayudar a mejorar la expresión del ARNm en experimentos de transfección y microinyección. Esta enzima requiere ARN con una estructura cap de 7-metilguanosina (m7GpppN) como sustrato y no puede utilizarse con ARN que contenga pN, ppN, pppN o GpppN en el extremo 5'. El ARN con capuchón se puede preparar mediante transcripción in vitro utilizando un análogo de capuchón o mediante un proceso enzimático con la enzima de capuchón de Vaccinia.
Componentes
| Componentes | 2.5KU | 10KU | 50KU | 500 KU | 5000KU |
| ARNm Cap2'-O-Metiltransferasa (50 U/μL) | 0,05 mL | 0,2 mL | 1 mL | 10 ml | 100 ml |
| Amortiguador de taponamiento 10× | 0,1 mL | 0,4 mL | 2×1 mL | 2×10 mL | 2×100 ml |
Almacenamiento
Conservar entre -25 y -15 °C. Válido durante 2 años (evitar la congelación y descongelación repetidas).
Búfer de almacenamiento
20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glicerol.
Definición de actividad
Una unidad (U) de actividad se define como la cantidad de enzima necesaria para metilar 10 pmol de transcrito de ARN con caperuza de 80 nt en 1 hora a 37 °C.
Control de calidad
- Actividad exonucleasa: Cuando se hicieron reaccionar 50 U de este producto con 1 μg de ADN digerido con λ-Hind III a 37 °C durante 16 horas, la banda electroforética del ADN permaneció inalterada.
- Actividad endonucleasa: Cuando se hicieron reaccionar 50 U de este producto con 1 μg de ADN λ a 37 °C durante 16 horas, la banda electroforética del ADN permaneció inalterada.
- Actividad de la nickasa: Cuando se hicieron reaccionar 50 U de este producto con 1 μg de pBR322 a 37 °C durante 16 horas, la banda electroforética del ADN permaneció inalterada.
- Actividad de la ARNasa: Cuando se hicieron reaccionar 50 U de este producto con 1,6 μg de ARN MS2 a 37 °C durante 4 horas, la banda electroforética del ARN permaneció inalterada.
- ADN residual de E. coli: Se detectó ácido nucleico residual en 50 U de este producto mediante qPCR TaqMan específica para el ADNr 16S de E. coli, y el genoma residual de E. coli fue ≤1 copia.
- Endotoxina: LAL-Test, Farmacopea China Edición 2020 Parte IV Reglas generales de la prueba de límite de gel (1143), contenido de endotoxina bacteriana ≤ 10 EU/mg.
Sistema de reacción y condiciones
- Diluya la cantidad adecuada de ARN con caperuza a 16 μL con agua libre de RNasa.
- Calentar el ARN diluido a 65 °C durante 5 minutos y, a continuación, colocarlo en hielo durante 5 minutos.
- Prepare la mezcla de reacción según la siguiente tabla (aplicable a reacciones de metilación de hasta 10 μg de ARN con caperuza):
| Componentes | Volumen |
| ARN desnaturalizado con capuchón | 16 µL |
| 10× Amortiguador de taponamiento* | 2 µL |
| SAM (4 mM) | 1 µL |
| ARNm Cap2'-O-Metiltransferasa (50 U/μL) | 1 µL |
| ddH2EL | Hasta 20 µL |
*Tampón de bloqueo 10×: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 °C), 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT.
4. Incubar a 37 °C durante 1 hora (para secuencias de ARN de menos de 200 nt de longitud, aumentar el tiempo de incubación a 2 horas).
Aplicaciones
Mejorar la expresión de ARNm en experimentos de microinyección y transfección.
Notas
- Antes de iniciar la reacción, el ARN debe purificarse y disolverse en agua libre de nucleasas. Todas las soluciones deben estar libres de EDTA e iones de sal.
- Antes de la reacción, se recomienda calentar la muestra de ARN a 65 °C durante 5 minutos para eliminar las estructuras secundarias del extremo 5' del transcrito. Si el extremo 5' del transcrito es complejo, el tiempo de calentamiento puede extenderse a 10 minutos.
- El reactivo SAM es menos estable a pH 7–8 y 37 °C, por lo que debe prepararse justo antes de su uso. Puede calcular previamente la cantidad necesaria de SAM y diluir la solución madre de 32 mM a una solución de trabajo de 4 mM antes de la reacción. Para evitar la degradación del SAM, la solución de trabajo debe mantenerse en hielo.
- Por su seguridad y bienestar, utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante este procedimiento.