Premezcla RobuDirect Probe RT-qPCR plus-UNG HYA439-0225
detalles del producto
RobuDirect Probe RT-qPCR Premix plus-UNG es un reactivo específico que elimina la necesidad de extracción y purificación de ácidos nucleicos de las muestras, permitiendo la detección cuantitativa por fluorescencia de genes diana mediante RT-PCR en un solo paso (método basado en sonda). Gracias a su excepcional tolerancia a los inhibidores, este reactivo permite la amplificación y detección directa mediante RT-PCR en un solo paso de sangre total anticoagulada, plasma, suero, hisopos faríngeos, saliva y otras muestras, sin necesidad de extracción ni purificación previa de ácidos nucleicos. Formulado con la enzima TS-UNG y un sistema de tampón optimizado que contiene dUTP, previene eficazmente las reacciones falsas positivas causadas por productos de PCR residuales y contaminación por aerosoles.
Componentes
1. 25×RobuDirect RTase/UNG Mix-0225
2. 2×RobuDirect RT Premix Buffer (dUTP) -0225
Almacenamiento
Almacenar a -20±5℃; mezclar bien antes de usar y evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Instrucciones
1. Preparación del sistema de reacción qRT-PCR
| Componentes | Volumen de 25 µL | Volumen de 50 µL | Concentración final |
| 2×RobuDirect RT Premix Buffer (dUTP) -0225 | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 25×RobuDirect RTase/UNG Mix-0225 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mezcla de cebadores y sondas 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN molde** | — | — | — |
| ddH2EL | A 25 µL | A 50 µL | — |
Por lo general, una concentración final de cebador de 0,2 μM proporciona resultados óptimos; si el rendimiento de la reacción es deficiente, la concentración del cebador puede ajustarse entre 0,2 y 1 μM. La concentración de la sonda se optimiza normalmente entre 0,1 y 0,3 μM. Se recomienda realizar un experimento de gradiente de concentración para encontrar la combinación óptima de cebador y sonda.
Los distintos tipos de muestras biológicas varían en el tipo y contenido de inhibidores, así como en el número de copias de los genes diana; el impacto de las diferentes soluciones de conservación de muestras (por ejemplo, la solución de conservación de hisopos) en la reacción de amplificación también difiere. Por lo tanto, el volumen óptimo de muestra en el sistema de reacción debe determinarse en función de las condiciones reales, como el tipo de muestra y la sensibilidad de detección requerida. Si es necesario, la muestra puede diluirse con agua libre de nucleasas o tampón TE antes de cargarla. Los volúmenes de muestra recomendados son los siguientes:
| Tipo de muestra | Agregar 50 µL del sistema de reacción | Relación de muestreo máxima |
| AWB | 2,5 µL | 5% |
| Plasma | 10 µL | 30% |
| Suero | 10 µL | 30% |
| Hisopado de garganta | 10 µL | 20% |
| Saliva | 10 µL | 20% |
2. Programa de reacción
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Transcripción inversa | 50℃ | 10-20 minutos | 1 |
| Predesnaturalización | 95℃ | 1-5 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Recocido y extensión | 56~64℃ | 20-60 s |
* La enzima TS-UNG, sensible a la temperatura, contenida en este producto puede realizar la digestión a temperatura ambiente y volverse inactiva durante el proceso de transcripción inversa.
Control de calidad
1. Detección de funciones: sensibilidad, especificidad y repetibilidad de la qRT-PCR.
2. Ausencia de actividad de nucleasas exógenas: ausencia de contaminación por endonucleasas y exonucleasas exógenas.
Información técnica
Este sistema suele utilizar 50 °C para la retrotranscripción, pero la temperatura puede optimizarse entre 42 °C y 55 °C. Según las características de la reacción, el tiempo de retrotranscripción puede optimizarse entre 5 y 30 minutos. Es adecuado para reacciones de RT-PCR cuantitativa multiplex.
2. Si se presentan problemas como valores de fluorescencia excesivamente bajos o una inhibición significativa de la amplificación, se recomienda reducir el volumen de la muestra o diluirla antes de añadirla. Como alternativa, manteniendo el mismo volumen de muestra, aumentar el volumen de reacción (60-100 µL) puede mejorar la situación.
3. La toma de muestras de sangre, saliva y frotis faríngeo debe realizarse de acuerdo con los procedimientos operativos estándar clínicos. Para evitar la degradación de los ácidos nucleicos, se pueden utilizar muestras recién recolectadas.
4. Para cebadores con bajas temperaturas de hibridación o para la amplificación de fragmentos de más de 200 pb, se recomienda un método de tres pasos.
5. Los distintos genes que se van a amplificar presentan diferentes eficiencias de utilización de dUTP y sensibilidad a las enzimas UNG. Por lo tanto, si el uso del sistema UNG reduce la sensibilidad de detección, se debe ajustar y optimizar el sistema de reacción. Para obtener asistencia técnica, póngase en contacto con nuestra empresa.
6. Utilice las regiones y pipetas específicas antes y después de la amplificación, use guantes durante el procedimiento y cámbielos con frecuencia. No abra el tubo de reacción una vez finalizada la reacción de PCR para minimizar la contaminación de la muestra con el producto de PCR.
7. ¡Solo para fines de investigación!