Kit de eliminación de ARNr NGS (ARNr e ITS/ETS) HYD218
Este kit utiliza digestión con RNasa H para eliminar el ARN ribosómico y las regiones 45S ITS/ETS del ARN total de humanos, ratones y ratas, conservando así el ARN mensajero (ARNm) y otros ARN no codificantes. Este kit ofrece buenos resultados en la eliminación de ARN ribosómico tanto para ARN total intacto como parcialmente degradado (como el ARN de muestras FFPE). Dado que las muestras FFPE degradadas suelen contener una mayor proporción de ITS/ETS que las muestras de tejido fresco, las sondas para la región 45S ITS/ETS de humanos, ratones y ratas incluidas en este kit pueden aumentar significativamente la proporción de datos válidos en los resultados de secuenciación tras la eliminación mediante este kit.
Componentes
| Componentes | 24 T | 96 T |
| Tampón de hibridación | 72 μL | 288 μL |
| Mezcla de sondas humanas (ARNr e ITS/ETS) | 48 μL | 192 μL |
| Tampón de RNasa H | 72 μL | 288 ml |
| RNasa H | 48 μL | 192 ml |
| Tampón de DNasa I | 660 μL | 2×1320 μL |
| DNasa I | 60 μL | 240 μL |
Almacenamiento
Almacenar a -25~-15℃ durante 1 año.
Instrucciones
1. Hibridación de sondas
1. Saque la sonda y el tampón de hibridación de -20 °C, descongélelos, inviértalos y mézclelos, y colóquelos en hielo para su uso posterior.
2. Preparar la muestra de ARN: Calcular el volumen de muestreo de ARN en función de la cantidad inicial y la concentración de la muestra, y diluir a 10 μL con H libre de nucleasas2
3. Prepare el sistema de reacción de eliminación de ARNr en un tubo de PCR de 200 μL según la Tabla 1.
Tabla 1 Sistema de reacción de hibridación de sondas
| Componentes | Volumen |
| Tampón de hibridación | 3 μL |
| Mezcla de sondas humanas (ARNr e ITS/ETS) | 2 μL |
| ARN total | 10 (100 ng~1 μg) |
| RNasa H | 48 μL |
| Tampón de DNasa I | 660 μL |
| DNasa I | 60 μL |
4. Utilice una pipeta para soplar y mezclar suavemente, y centrifugue la solución de reacción hasta el fondo del tubo.
5. Coloque el tubo de PCR anterior en el instrumento de PCR y realice la reacción de hibridación de la sonda de acuerdo con el programa de reacción que se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2 Programa de reacción de hibridación de sondas
| Temperatura | Tiempo |
| Calentar la tapa a 105 °C. | En |
| 95°C | 2 minutos |
| 95°C-22°C | 0,1 °C/s |
| 22°C | 5 minutos |
| 4°C | sostener |
2. Digestión con RNasa H
1. Retire el reactivo de digestión con RNasa H de -20 °C, descongélelo, inviértalo y mézclelo, y colóquelo en hielo para su uso posterior. Prepare el sistema de reacción de digestión con RNasa H como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3 Sistema de reacción de digestión con RNasa H
| Componentes | Volumen |
| Tampón de RNasa H | 3 μL |
| RNasa H | 2 μL |
| Producto del paso anterior | 15 μL |
Nota: El tampón de RNasa H y la RNasa H deben añadirse por separado. Si necesita preparar una mezcla debido a la gran cantidad de muestras, hágalo justo antes de usarla, ya que de lo contrario afectará la eficacia de la eliminación.
2. Utilice una pipeta para soplar y mezclar suavemente, y centrifugue la solución de reacción hasta el fondo del tubo.
3. Coloque el tubo de PCR anterior en el instrumento de PCR y configure el programa de reacción: tapa caliente 50 °C; 37 °C, 30 min; 4 °C, mantener, y realice la reacción de digestión con RNasa H.
3. Digestión con DNasa I
1. Retire el reactivo de digestión con DNasa I de -20 °C, descongélelo, mézclelo por inversión y colóquelo en hielo para su uso posterior. Prepare el sistema de reacción de digestión con DNasa I como se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4. Sistema de reacción de digestión con DNasa I.
| Componentes | Volumen |
| Tampón de DNasa I | 27,5 μL |
| DNasa I | 2,5 μL |
| Producto del paso anterior | 20 μL |
2. Utilice una pipeta para pipetear suavemente y mezclar, y centrifugue la solución de reacción hasta el fondo del tubo.
3. Coloque el tubo de PCR anterior en un instrumento de PCR y configure el programa de reacción: tapa caliente a 50 °C; 37 °C, 30 min; 4 °C, mantener, y realice la reacción de digestión con DNasa I.
4. Purificación de ARN
1. Preparación: Saque las perlas magnéticas NGS RNA Cleaner del refrigerador y equilibre a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Prepare etanol al 80% con H libre de nucleasas2
2. Agite o invierta las perlas magnéticas para asegurar una mezcla completa.
3. Pipetee 110 μL de NGSRNA Cleaner (2,2×, Perlas:ADN=2,2:1) en el producto del paso anterior, pipetee para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 min.
4. Coloque el tubo de PCR en un soporte magnético para separar las perlas magnéticas del líquido. Una vez que la solución esté transparente (aproximadamente 3 minutos), retire con cuidado el sobrenadante.
5. Mantenga el tubo de PCR en el soporte magnético, agregue 200 μL de etanol al 80% recién preparado para lavar el soporte magnético. Incube a temperatura ambiente durante 30 segundos y retire con cuidado el sobrenadante.
6. Repita el paso 5) para un total de dos enjuagues. Use una pipeta de 10 μL para aspirar el líquido restante.
7. Mantenga el tubo de PCR en el soporte magnético y abra la tapa para secar las perlas magnéticas a temperatura ambiente (5-10 minutos).
8. Elución de ARN: Retire el tubo de PCR del soporte magnético, agregue 11 μL de H libre de nucleasas2O(o utilice el volumen correspondiente de H libre de nucleasa2(O o tampón de elución adecuado para experimentos posteriores), use una pipeta para soplar suavemente hasta que esté completamente mezclado y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
9. Centrifugue brevemente el tubo de PCR y colóquelo en un soporte magnético. Una vez que la solución esté transparente (aproximadamente 3 minutos), transfiera cuidadosamente 10 μL del sobrenadante (cantidad ajustable según el volumen de elución seleccionado en el paso 7) a un nuevo tubo de PCR libre de nucleasas.
Nota: Realice los experimentos posteriores inmediatamente con las muestras eluidas o guárdelas a -80 °C.
Notas
1. Utilice consumibles libres de RNasa y limpie el área experimental con regularidad. Se recomienda utilizar RNAZap de Thermo Fisher.TMEspray de alta eficacia para la eliminación de ácidos nucleicos y para eliminar la contaminación por RNasa.
2. Las muestras de ARN no deben contener contaminación por ADN genómico. Si la muestra contiene residuos de ADN genómico, deberá digerirse y purificarse con DNasa I antes de utilizar este kit.
3. El volumen máximo de muestra de ARN que se puede introducir es de 10 μL. Si el volumen de la muestra es grande, se puede concentrar previamente.
4. Si es necesario utilizar el paso de digestión con RNasa H con Mix, prepárelo ahora; habrá un excedente en las especificaciones de 24 T de este componente.
5. Por su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.
6. ¡Este producto es solo para fines de investigación científica!