PNGase F-Fast-HYI152
PNGase F es el método enzimático más eficaz para eliminar casi todos los oligosacáridos unidos a N de las glicoproteínas. PNGase F es una amidasa que escinde los residuos de GlcNAc y asparagina más internos de los oligosacáridos de alta manosa, híbridos y complejos de las glicoproteínas unidas a N. Para un control eficaz del proceso, es fundamental obtener la distribución precisa de los N-glicanos en poco tiempo. Generalmente, se necesitan varias horas para hidrolizar y liberar los N-glicanos del anticuerpo con PNGase F, y posteriormente realizar la derivatización de glicanos y el análisis por HPLC o espectrometría de masas. En particular, una desglucosilación incompleta puede generar resultados sesgados que no reflejen la composición correcta del anticuerpo terapéutico. PNGase F-Fast es un reactivo mejorado que libera los N-glicanos del anticuerpo terapéutico en pocos minutos. Todos los N-glicanos pueden liberarse rápidamente sin sesgos y están listos para el análisis posterior mediante cromatografía o espectrometría de masas, para determinar rápidamente el perfil de glicosilación de los anticuerpos..
Componentes
| Componentes | Tamaño |
| PNGase F-Fast | 50 µl |
| 5 × tampón PNGase F-Fast | 1000 µl |
Especificación
| Apariencia | Líquido |
| Exoglicosidasa | No se detectó ninguna actividad. |
| Endoglicosidasa F1 | No se detectó ninguna actividad. |
| Endoglicosidasa F2 | No se detectó ninguna actividad. |
| Endoglicosidasa F3 | No se detectó ninguna actividad. |
| Endoglicosidasa H | No se detectó ninguna actividad. |
| Proteasa | No se detectó ninguna actividad. |
Propiedades
| Número CE | 3.5.1.52 (Recombinante a partir de microorganismos) |
| Peso molecular | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Punto isoeléctrico | 8.14 |
| pH óptimo | 7.0-8.0 |
| Temperatura óptima | 65 °C |
| Especificidad del sustrato | Escisión de los enlaces glucosídicos entre los residuos de GlcNAc y asparagina. |
| Sitios de escisión de IgG | Desglucosilación y mantenimiento del oligosacárido intacto |
| Activadores | TDT |
| inhibidor | Hoja de datos de seguridad |
| Temperatura de almacenamiento | -25～-15 ℃ |
| Inactivación por calor | Una mezcla de reacción de 20 µL que contiene 1 µL de PNGasa F se inactiva mediante incubación a 75 °C durante 10 minutos. |
Aplicaciones
Esta enzima resulta útil para eliminar los residuos de carbohidratos de los anticuerpos y las proteínas de fusión en cuestión de minutos.
Figura 1. Especificidad del sustrato de PNGase F-Fast.
Figura 2. Sitios de escisión de la IgG. La flecha roja indica los sitios de escisión de la IgG.
Condiciones de reacción
Protocolo de un solo paso
- Disuelva 100 µg de anticuerpo en agua desionizada hasta obtener un volumen de 16 µl.
- Agregue 4 µl de tampón 5×PNGase F-Fast y mezcle.
- Agregue 1 µl de PNGase F-Fast y mezcle.
- Incubar la reacción a 50 °C durante 10 minutos.
- Preparar N-glicanos para su derivatización para análisis posteriores.
Protocolo de dos pasos
Algunos anticuerpos requieren un paso de precalentamiento para una desglucosilación eficaz.
- Disuelva 100 µg de anticuerpo en agua desionizada hasta obtener un volumen de 16 µl.
- Agregue 4 µl de tampón 5×PNGase F-Fast y mezcle.
- Incubar a 80 °C durante 2 minutos y enfriar en hielo.
- Agregue 1 µl de PNGase F-Fast y mezcle.
- Incubar la reacción a 50 °C durante 10 minutos.
- Preparar N-glicanos para su derivatización para análisis posteriores.