Kit de detección de ARN bicatenario RIG-1 HYJ522
El gen I inducible por ácido retinoico (RIG-I) funciona como un receptor de reconocimiento de patrones citosólico que inicia la inmunidad antiviral innata al detectar ARN virales exógenos. Estructuralmente, RIG-I está compuesto por tres dominios funcionales principales: el dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD) para la transducción de señales, el dominio de helicasa de ARN DExD/H-box y el dominio C-terminal para la unión al ARN. El dominio de helicasa de ARN está asociado con actividades de hidrólisis de ATP dependientes de ARN, que se activan al unirse al ARN de doble cadena (dsRNA), lo que conduce a la hidrólisis de ATP en ADP y fosfato inorgánico (Pi). Este kit cuantifica el contenido de dsRNA en muestras midiendo la producción de ADP durante la reacción entre RIG-I y la muestra. El ensayo se realiza en una placa de múltiples pocillos y puede detectar reacciones en volúmenes tan bajos como 5 μL. La detección implica tres pasos:
1. Reacción RIG-I: Mezclar la enzima RIG-I, el ATP y la muestra, seguido de la incubación.
2. Agotamiento de ATP: Añada un volumen igual del reactivo 1 para agotar el ATP residual.
3. Detección de ADP: Se añade el reactivo 2 para convertir el ADP de nuevo en ATP, que posteriormente se cuantifica mediante una reacción de luciferasa/luciferina. La señal luminiscente se mide con un lector de placas. El contenido de ARN bicatenario se calcula a partir de una curva estándar.
Componentes
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| Componentes | 96 T | 384 T |
| Reacción ATPasa de RIG-I | Enzima RIG-I (1 µM) | 100 µL | 400 µL |
| Tampón de reacción RIG-I 10× | 0,25 ml | 1 ml | |
| 1M TDT | 20 μL | 50 μL | |
| 10 mM ATP | 25 μL | 100 μL | |
| Estándar (UTP, 25 ng/μL) | 40 μL | 150 μL | |
| Estándar (N1-Me-pUTP, 25 ng/μL) | 40 μL | 150 μL | |
| Medición de ADP | Reactivo 1 - Tampón de ensayo | 0,5 ml | 2 ml |
| Reactivo 1-Enzima (5×) | 0,125 ml | 0,5 ml | |
| Reactivo 1-0,5 M MnCl2 | 25 μL | 100 μL | |
| Reactivo 2 | 1,25 ml | 5 ml | |
| Placa de 384 pocillos | 1 plato | 1 plato |
Almacenamiento
1. Envío con hielo seco. Almacene el sistema a -25~-15℃.
2. Antes de su uso, descongele y mezcle bien todos los componentes a temperatura ambiente. Una vez preparados, divida todos los reactivos en alícuotas y guárdelos a -25 a -15 °C. Prepare el sistema RIG-I y el reactivo 1 justo antes de cada uso. El reactivo 2 puede conservarse a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 24 horas sin una pérdida significativa de señal.
Materiales adicionales necesarios
1. Lector de microplacas por quimioluminiscencia.
2. Agitador de microplacas.
3. Centrífuga portátil.
4. Puntas de pipeta y tubos de centrífuga libres de RNasa.