Kit ELISA de inhibidor de RNasa-HYJ529
Este kit emplea un ensayo inmunoenzimático (ELISA) acoplado a un sistema de biotina-estreptavidina para la detección cuantitativa de las concentraciones de inhibidores de la RNasa en muestras. La microplaca está pre-recubierta con anticuerpos anti-inhibidor de la RNasa. El inhibidor de la RNasa presente en la muestra se une a los anticuerpos inmovilizados en los pocillos. Posteriormente, se añade un anticuerpo anti-inhibidor de la RNasa biotinilado, que se une al inhibidor de la RNasa en la muestra. Tras el lavado, se introduce estreptavidina conjugada con HRP para que se una al anticuerpo anti-inhibidor de la RNasa biotinilado. Después de la incubación, la HRP-estreptavidina no unida se elimina mediante lavado. A continuación, se añade una solución de sustrato TMB, que es catalizada por la HRP para generar un producto azul, que se torna amarillo al añadir una solución de parada ácida. La intensidad de la coloración amarilla es directamente proporcional a la concentración de inhibidor de la RNasa en la muestra. La absorbancia (valor de DO) se mide a 450 nm utilizando un lector de microplacas, y la concentración de inhibidor de RNasa en la muestra se calcula en función de una curva estándar.
Componentes
| Componentes | 48T | 96T |
| Microplaca ELISA | 8×6 | 8×12 |
| Anticuerpo de detección biotinilado (100x) | 60 µL | 120 µL |
| HRP-estreptavidina (100x) | 60 µL | 120 µL |
| Tampón de dilución | 25 ml | 50 ml |
| solución de sustrato TMB | 6 ml | 12 ml |
| Solución de parada | 3 ml | 6 ml |
| Tampón de lavado concentrado (10x) | 25 ml | 50 ml |
| Estándar (0,1 mg/ml) | 25 µL | 50 µL |
| Selladora de placas | 2 piezas | 4 piezas |
Almacenamiento
- El estándar (0,1 mg/mL) del kit debe conservarse entre -25 y -15 °C, mientras que los demás componentes deben almacenarse entre 2 y 8 °C. Para garantizar la estabilidad del almacenamiento, evite la exposición a la luz intensa. Su vida útil es de 12 meses.
- Para kits usados: Una vez abierta la microplaca, cubra los pocillos no utilizados con un sellador de placas y vuelva a colocarlos en la bolsa de aluminio que contiene el desecante. Cierre bien la bolsa de aluminio y guárdela a 2-8 °C lo antes posible después de su uso. Los demás reactivos también deben guardarse a 2-8 °C lo antes posible después de su uso.
Materiales necesarios pero no suministrados
- Lector de microplacas con filtro de 450 ± 10 nm (mejor si puede detectar a longitudes de onda de 450 y 650 nm).
- Agitador de microplacas.
Instrucciones
Antes de comenzar
1. Deje que todos los componentes del kit y las muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 ℃) antes de usarlos. Si no va a utilizar todo el kit de una sola vez, extraiga únicamente las tiras reactivas y los reactivos necesarios para el experimento en cuestión y deje el resto en las condiciones requeridas.
2. Tampón de lavado: diluya 50 ml de tampón de lavado concentrado 10× con 450 ml de agua desionizada o destilada para preparar 500 ml de tampón de lavado 1×.
3. Estándar: Diluya el concentrado estándar (0,1 mg/ml) con tampón de dilución a 128 ng/ml, 64 ng/ml, 32 ng/ml, 16 ng/ml, 8 ng/ml, 4 ng/ml, 2 ng/ml y 0 ng/ml. Recomendamos diluir los estándares según la siguiente tabla:
| No. | Final Con. (pg/μL) | Instrucciones de dilución | |
| búfer STE | Estándar | ||
| 1000 | 198 µL | 2 μL de estándar de 0,1 mg/mL | |
| A | 128 | 436 µL | 64 μL 1000 ng/mL |
| B | 64 | 250 µL | 250 μL de solución A |
| do | 32 | 250 µL | 250 μL de solución B |
| D | 16 | 250 µL | 250 μL de solución C |
| Y | 8 | 250 µL | 250 μL de solución D |
| F | 4 | 250 µL | 250 μL de solución E |
| GRAMO | 2 | 250 µL | 250 μL de solución F |
| H | 0 | 250 µL | / |
4. Solución de trabajo de anticuerpo de detección biotinilado y estreptavidina-HRP: centrifugue brevemente la solución madre antes de usarla. Dilúyala a la concentración de trabajo con tampón de dilución.
5. Sustrato TMB: Aspire la dosis necesaria de la solución con puntas esterilizadas y no vuelva a verter la solución residual en el vial. El sustrato TMB es sensible a la luz; evite exponerlo a la luz durante periodos prolongados.
Utilizando el protocolo
- Determine la cantidad de tiras necesarias para el ensayo. Inserte las tiras en los soportes correspondientes. Las tiras sobrantes que no se utilicen en este ensayo deben guardarse en la bolsa con desecante. Cierre bien la bolsa para su almacenamiento refrigerado.
- Agregue 100 μL de cada una de las diluciones del estándar, el blanco y las muestras en los pocillos correspondientes. Cubra con el sellador de placas. Incube durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 500 rpm. * Cuando no se pueda determinar el contenido de inhibidor de RNasa en la muestra de prueba, se recomienda usar el tampón diluyente para diluir la muestra mediante dilución múltiple y determinar el factor de dilución de la muestra en función del valor de la primera prueba. Si se determina el factor de dilución de la muestra, dilúyala con el tampón diluyente para la prueba. Asegúrese de que los valores calculados a partir de la curva estándar estén dentro del rango lineal (2-128 ng/ml).
- Paso de lavado: Aspire la solución y lave cada pocillo con 300 μL de tampón de lavado, dejándolo reposar de 15 a 30 segundos. Deseche completamente el tampón de lavado golpeando la placa sobre papel absorbente. Repita el lavado tres veces.
- Agregue 100 μL de solución de trabajo de anticuerpo de detección biotinilado a cada pocillo. Cubra con el sellador de placas. Incube durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 500 rpm.
- Repita el paso de lavado.
- Agregue 100 μL de solución de trabajo de HRP-estreptavidina a cada pocillo. Cubra con el sellador de placas. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación a 500 rpm.
- Repita el paso de lavado. 8. Añada 100 μL de solución de sustrato TMB a cada pocillo. Cubra con el sellador de placas. Incube a 37 °C en la oscuridad durante 10 minutos. El líquido se tornará azul al añadir la solución de sustrato.
- Agregue 50 μL de solución de parada a cada pocillo. El líquido se tornará amarillo al añadir la solución de parada. A continuación, utilice el lector de microplacas y realice la medición a 450 nm inmediatamente.
Cálculo de resultados
- Calcule el valor promedio de absorción de luz del estándar, el control en blanco y la muestra. La curva de calibración se traza con la concentración del producto estándar como coordenada horizontal (X) y el valor promedio de absorción de luz del producto estándar como coordenada vertical (Y). (El valor de absorción de luz en el modo de detección de doble longitud de onda es de 450 nm menos 650 nm).
- Se recomienda realizar el cálculo con un software de ajuste de curvas basado en computadora, como Curve Expert 1.3 o ELISA Calc, utilizando un modelo de ajuste no lineal de 4 parámetros.
Actuación
- Límite inferior de detección:
- Límite inferior de cuantificación: 2 ng/mL
- Linealidad: 2-128 ng/mL
- Precisión: CV intraensayo ≤10%, CV interensayo ≤15%
- Recuperación: 80%~120%
- Especificidad: solo se reconoce específicamente el inhibidor de la RNasa; otras enzimas utilizadas en las pruebas de imagen in vitro no interfieren con las mediciones.
Notas
- La temperatura y el tiempo de reacción del TMB son fundamentales; por favor, contrólelos estrictamente siguiendo las instrucciones.
- Durante el proceso de lavado, el líquido de lavado debe dejarse en contacto con la placa durante 15 a 30 segundos y luego secarse para eliminar por completo los componentes adsorbidos no específicos.
- Todos los reactivos deben mezclarse completamente antes de su uso y se deben evitar burbujas durante la adición de la muestra o los reactivos.
- Si se han formado cristales en el tampón de lavado concentrado (10x), caliéntelo a 37℃ y mezcle suavemente hasta que los cristales se disuelvan por completo.
- Evite analizar muestras que contengan azida de sodio (NaN3), ya que destruirá la actividad de la peroxidasa de rábano picante y hará que el valor de detección sea bajo.
- No se deben mezclar diferentes lotes de reactivos. Además, no se deben mezclar las puntas de las pipetas para evitar la contaminación cruzada.
- Por su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes para realizar las operaciones experimentales.
- Este producto está destinado únicamente a fines de investigación y no debe utilizarse para diagnósticos médicos clínicos ni para otros fines irracionales.