Premezcla RobuDirect Probe RT-qPCR plus-UNG HYA438
detalles del producto
El kit 2x One-Step RT-qPCR Premix-UNG es un reactivo específico para reacciones cualitativas y cuantitativas mediante el método de sonda cuantitativa de fluorescencia RT-PCR de un solo paso. Este producto utiliza enzimas de amplificación de ADN modificadas con anticuerpos de alta afinidad y transcriptasas inversas de inicio en caliente. Gracias a la optimización exhaustiva del tampón, se logra una premezcla completa de enzimas, tampón y cebadores/sondas, lo que garantiza la estabilidad durante el almacenamiento prolongado a bajas temperaturas y facilita el uso del producto final. El reactivo incorpora un sistema anticontaminación dUTP/UNG, que previene eficazmente las reacciones falsas positivas causadas por residuos del producto de PCR y contaminación por aerosoles, asegurando así resultados precisos.
Componentes
1. Mezcla de RTasa/UNG 25×
2. Tampón de premezcla 2×RT (dUTP)
Almacenamiento
Conservar a -20 ℃ durante periodos prolongados; a 4 ℃ hasta 3 meses. Mezclar bien antes de usar y evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Instrucciones
1. Preparación del sistema de reacción qRT-PCR
| Componentes | Volumen de 25 µL | Volumen de 50 µL | Concentración final |
| 2× Tampón de premezcla RT (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| Mezcla de RTasa/UNG 25× | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mezcla de cebadores y sondas 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN molde** | — | — | — |
| ddH2EL | A 25 µL | A 50 µL | — |
Generalmente, una concentración final de cebadores de 0,2 μM produce buenos resultados; en caso de un rendimiento deficiente de la reacción, la concentración de cebadores puede ajustarse entre 0,2 y 1 μM. La concentración de sonda se optimiza normalmente entre 0,1 y 0,3 μM. Se pueden realizar experimentos de gradiente de concentración para encontrar la combinación óptima de cebadores y sondas.
**Los diferentes tipos de plantillas de ARN contienen diferentes números de copias del gen objetivo; si es necesario, se pueden realizar diluciones seriadas para determinar la cantidad óptima de plantilla de ARN que se debe añadir.
2. Programa de reacción
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Transcripción inversa | 50℃ | 5-10 minutos | 1 |
| Predesnaturalización | 95℃ | 30 segundos - 1 minuto | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Recocido y extensión | 56~64℃ | 20-60 s |
* La enzima TS-UNG, sensible a la temperatura, contenida en este producto puede realizar la digestión a temperatura ambiente y volverse inactiva durante el proceso de transcripción inversa.
Control de calidad
1. Detección de funciones: sensibilidad, especificidad y repetibilidad de la qRT-PCR.
2. Ausencia de actividad de nucleasas exógenas: ausencia de contaminación por endonucleasas y exonucleasas exógenas.
Información técnica
1. Este sistema contiene la enzima TS-UNG, que degrada las plantillas de ADN que contienen uracilo a temperatura ambiente o a 25 °C y se inactiva durante la transcripción inversa, por lo que no afecta a la posterior amplificación por PCR utilizando ADNc como plantilla.
2. Este sistema suele utilizar 50 °C para la transcripción inversa, pero la temperatura se puede optimizar entre 42 °C y 55 °C. Según las características de la reacción, el tiempo de transcripción inversa se puede optimizar entre 5 y 30 minutos.
3. La nueva transcriptasa inversa utilizada en este sistema es una versión genéticamente modificada de M-MLV, lo que le confiere una mayor tolerancia a la temperatura y una mayor temperatura de transcripción inversa, lo que resulta en una mayor eficiencia de transcripción inversa para plantillas de ARN complejas.
4. Este sistema presenta buena estabilidad y aplicabilidad, lo que lo hace ideal para la detección de virus y plantillas de ARN complejas extraídas de tejidos. Proporciona resultados de amplificación más estables incluso con concentraciones de plantilla extremadamente bajas, lo que lo hace adecuado para su uso con reactivos de diagnóstico molecular de alta sensibilidad.
5. Para cebadores con temperaturas de hibridación más bajas o para la amplificación de fragmentos de más de 200 pb, se recomienda un método de tres pasos.
6. Los distintos genes que se van a amplificar presentan diferentes eficiencias de utilización de dUTP y sensibilidad a las enzimas UNG. Por lo tanto, si el uso del sistema UNG reduce la sensibilidad de detección, se debe ajustar y optimizar el sistema de reacción. Para obtener asistencia técnica, póngase en contacto con nuestra empresa.
7. Utilice las regiones y pipetas específicas antes y después de la amplificación, use guantes durante el procedimiento y cámbielos con frecuencia. No abra el tubo de reacción una vez finalizada la reacción de PCR para minimizar la contaminación de la muestra con el producto de PCR.
8. Para evitar la amplificación de productos de PCR residuales, se requiere un área experimental y una pipeta específicas para la amplificación. Utilice guantes y cámbielos con frecuencia; no abra el tubo de PCR después de la amplificación.