Transcriptasa inversa RTL (sin glicerol) HYB212
La transcriptasa inversa RTL es una ADN polimerasa dependiente de ARN que carece de actividad exonucleasa 3'→5' y posee actividad RNasa H. Esta enzima puede utilizar ARN como molde para sintetizar una cadena complementaria de ADN, lo que resulta útil para la síntesis de ADNc de primera cadena, especialmente para RT-LAMP. La transcriptasa inversa RTL (libre de glicerol) puede utilizarse para preparar preparados liofilizados, reactivos RT-LAMP liofilizados, etc.
Componentes
| Componentes | 1500U | 15000U | 150000U |
| Transcriptasa inversa RTL (sin glicerol) (15 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HH Búfer RTL | 1,5 ml | 4 x 1,5 mL | 5×10 ml |
| MgSO4(100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 mL | 3×10 mL |
Almacenamiento
Conservar entre -25 y -15 °C. Válido durante 18 meses.
Definición de unidad
Una unidad incorpora 1 nmol de dTTP en material precipitable con ácido en 20 minutos a 50 °C utilizando poli(A)•oligo(dT)25 como plantilla-cebador.
Control de calidad
1. Actividad residual de la endonucleasa: Una reacción de 50 µL que contiene 1 µg de λDNA y 15 unidades de RTL, incubada durante 16 horas a 37ºC, muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
2. Actividad residual de la exonucleasa: Una reacción de 50 µL que contiene 1 µg de ADN λ digerido con Hind III y 15 unidades de RTL, incubada durante 4 horas a 37 °C, muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
3. Actividad residual de la nickasa: Una reacción de 50 µL que contiene 1 µg de pBR322 superenrollado y 15 unidades de RTL incubada durante 4 horas a 37ºC muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
4. Actividad residual de la RNasa:Una reacción de 10 µL que contiene 0,48 µg de ARN MS2 y 15 unidades de RTL, incubada durante 4 horas a 37ºC, muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
5. E. coliADN genómico:Medido con E. coli kits de detección de HCD específicos, 15 unidades de RTL contienen menos de 1 E. coli genoma.
Sistema de reacción de transcripción inversa
| Componente | Volumen |
| ARN molde | opcional |
| Oligo(dT)18~25 (50 μM) o mezcla de cebadores aleatorios (60 μM) | 2 μL |
| Mezcla de dNTP (10 mM de cada uno) | 1 μL |
| Inhibidor de la ARNasa (40 U/μL) | 0,5 μL |
| Transcriptasa inversa RTL (sin glicerol) (15 U/μL) | 0,5 μL |
| 10 búferes HH RTL | 2 μL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 20 μL |
Nota: La dosis recomendada de ARN total es de 1 ng a 1 μg. La dosis recomendada de ARNm es de 50 ng a 100 ng.
Reacción programo
| Temperatura | Tiempo |
| 25 ºC* | 5 minutos |
| 55 ºC | 10 minutos** |
| 80 ºC | 10 minutos |
*Si se utiliza Random Primer Mix, se requiere un paso de incubación a 25 °C.
**Si se utiliza la mezcla de cebadores objetivo, se requiere un paso de incubación a 55 °C durante 10 a 30 minutos.
Lámpara RTsistema de reacción
| Componente | Volumen | Concentración final |
| ARN molde* | opcional | ≥10 copias |
| Mezcla de dNTP (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| Cebadores FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Cebadores F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Cebadores LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibidor de la ARNasa (40 U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Rxn |
| Transcriptasa inversa RTL (sin glicerol) (15 U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U |
| ADN polimerasa Bst 2.0 (8 U/μL) | 1 μL | 8 U |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10 búferes HH RTL / 10 búferes HH Bst 2.0 | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 25 μL | - |
Mezclar mediante agitación en vórtex y centrifugar brevemente para recoger la muestra. Incubar a temperatura constante entre 60 °C y 65 °C durante 1 hora.
Notas
1. Este producto formará un sólido blanco al almacenarse a -20 °C. Sáquelo de la nevera y colóquelo en hielo durante unos 10 minutos. Una vez descongelado, puede utilizarse agitándolo y mezclándolo.
2. El producto de ADNc se puede almacenar a -20 °C o -80 °C o utilizarse inmediatamente para PCR.
3. Para evitar la contaminación por ARNasa, mantenga limpia la zona experimental y utilice guantes y mascarillas limpios durante la operación.