Premezcla SYBR Green Fast qPCR HYA411
La PCR cuantitativa en tiempo real es una técnica que utiliza colorantes de ADN de doble cadena, generalmente SYBR.®Green I, para detectar cuantitativamente la cantidad inicial de ADN por amplificación. SYBR Green Fast qPCR Premix es un reactivo de fluorescencia para reacciones de qPCR que utilizan SYBR.®Verde I. Este producto proporciona datos en tiempo real sobre la amplificación del ADN durante la PCR mediante la detección cuantitativa de la señal de fluorescencia en SYBR.®Canales /FAM. Este producto utiliza la enzima Taq de arranque en caliente basada en anticuerpos para la amplificación, lo que mejora notablemente la especificidad del producto y garantiza el efecto de amplificación. Asimismo, mediante la optimización del sistema de tampón de mezcla para qPCR, el producto es apto para múltiples especies, lo que proporciona una herramienta potente para necesidades experimentales multidisciplinares. Este producto es una enzima premezclada 2X que contiene todos los componentes necesarios para la qPCR, excepto los cebadores y las plantillas, lo que facilita enormemente la manipulación experimental.
Componentes
| Componentes | 1 mL | 5 ml | 25 ml |
| Premezcla SYBR Green Fast qPCR* | 1 ml | 1 ml × 5 | 1 ml × 25 |
| Tinte de referencia ROX 50X I | 40 μL | 200 μL | 200 μL × 5 |
| Tinte de referencia ROX 50X II | 40 μL | 200 μL | 200 μL × 5 |
*Incluye la ADN polimerasa Taq de arranque en caliente, Mg2+, dNTPs, SYBR®Verde I, etc.
Almacenamiento
Este producto debe almacenarse a -20 ℃ para su conservación a largo plazo y debe protegerse de la luz.
Materiales necesarios
1. Tubos de PCR y otros materiales relacionados.
2. Cebadores específicos para qPCR y plantillas de ADN.
3. Placa de 96 pocillos para qPCR y membrana de sellado (película adhesiva).
Notas
1. La premezcla SYBR Green Fast qPCR debe descongelarse completamente antes de su uso. Protéjala de la luz directa y guárdela en la oscuridad.
2. La premezcla SYBR Green Fast qPCR contiene glicerol. Mezcle suavemente antes de usar para evitar la formación de burbujas; agite en vórtex y centrifugue antes de usar. Almacene inmediatamente a -20 °C después de su uso.
3. Este producto contiene ADN polimerasa. Mantener en hielo durante su uso. Para usos repetidos a corto plazo en un mismo día, se permite el almacenamiento temporal a 4 °C. Minimizar los ciclos de congelación y descongelación.
Instrumentos
1. Preparación experimental
1. Se recomienda elegir una longitud del producto de amplificación dentro del rango de 70-200 pb.
2. Se recomienda tomar un volumen de reacción de 20 μL, agregar 1 pg-50 ng de ADN como plantilla y configurar NTC (Control sin plantilla).
3. Para garantizar la precisión experimental, realice réplicas técnicas por triplicado para todas las muestras y controles.
4. El colorante de referencia ROX varía según el instrumento. Para saber si debe añadirse o no, consulte la tabla que aparece a continuación.
| Tipos Rox | Máquinas de qPCR |
| No ROX | Bio-Rad iCycler Serious, Roche Light Cycler Serious, Qiagen/Corbett Serious y otros. |
| Tinte de referencia ROX 50X I | ABI 7000/7300/7700/7900, ABI StepOne/StepOnePlus, Eppendorf y otros. |
| Tinte de referencia ROX 50X II | ABI 7500, ABI ViiATM7, ABI QuantaStudio series, Stratagene series, Corbett Rotor Gene 3000 y otros. |
2. qPCR Rreacciónsistema
| Componentes | Volumen |
| Premezcla SYBR Green Fast qPCR | 10 µL |
| Cebador directo (10 µM)** | 0,4 µL |
| Cebador inverso (10 µM)** | 0,4 µL |
| ADN genómico o ADNc* | 2 µL |
| ROX I / II (si es necesario, seleccione según el modelo del instrumento) | 0,4 µL |
| ddH2EL | Hasta 20 µL |
* Normalmente, la concentración final del cebador es de 0,2 μM, y se pueden obtener buenos resultados. Se puede utilizar una concentración final de 0,1-1,0 μM como referencia para establecer el rango. En caso de baja eficiencia de amplificación, se puede aumentar la concentración de los cebadores. Si se producen reacciones no específicas, se puede reducir la concentración de los cebadores y optimizar el sistema de reacción.
** Utilizando 10 pg-10 ng de ADN genómico o 10 pg-100 ng de ADNc como cantidad de referencia de plantilla, se puede realizar una dilución en gradiente de la plantilla para determinar su uso óptimo debido a los diferentes números de copias de los genes diana contenidos en las plantillas de diferentes especies. Además, cuando se utiliza ADNc (solución de reacción de RT) de la reacción de RT qPCR de dos pasos como plantilla, la cantidad añadida no debe exceder el 10 % del sistema de reacción de qPCR.
3. qPCR RreacciónPrograma
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Predesnaturalización | 95 ℃ | 3 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 5 s | 40-45 |
| Recocido y extensión | 60℃ | 30-34 años* | |
| Curva de fusión | Instrumento predeterminado | / | 1 |
* Confirme que se realiza una adquisición de señal después de cada paso de extensión. El tiempo de extensión varía según la máquina: 30 s para StepOne Plus, 31 s para 7300 y 34 s para 7500. Si no se especifica lo contrario, se utilizará el valor predeterminado de 30 s.