Premezcla SYBR Green qPCR HYA412
La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) es una técnica potente para detectar la entrada inicial de ADN en una reacción de PCR mediante la acumulación de señal de fluorescencia. El colorante de doble cadena de ADN, SYBR®El colorante Green I es el más utilizado en qPCR. El SYBR Green qPCR Premix contiene un colorante de referencia universal de diseño innovador, que permite una mayor resolución de señal y es compatible con todos los instrumentos de qPCR actuales (incluidos los que requieren modo ROX alto, modo ROX bajo y modo sin ROX). También contiene la ADN polimerasa Taq de inicio en caliente para evitar resultados de amplificación inesperados. Además, el SYBR Green qPCR Premix es una mezcla de reacción de qPCR optimizada que contiene todos los componentes necesarios, excepto los cebadores y la plantilla. Es práctico para la experimentación y adecuado para múltiples especies. Estas características lo convierten en una herramienta ideal para la investigación cuantitativa de genes.
Componentes
| Componentes | 1 mL | 5 ml | 25 ml |
| Premezcla SYBR Green qPCR* | 1 ml | 5 × 1 ml | 25 × 1 ml |
*Incluye la ADN polimerasa Taq de arranque en caliente, Mg2+, dNTPs, SYBR® Green I, tinte Universal ROX, etc.
Instrumentos
No se requiere ningún colorante de referencia adicional. La premezcla SYBR Green qPCR es adecuada para todos los instrumentos de qPCR que se utilizan actualmente (incluidos los que tienen modo ROX alto, modo ROX bajo y los que no requieren modo ROX).
Almacenamiento
Este producto debe almacenarse a -20 ℃ para su conservación a largo plazo y debe protegerse de la luz.
Materiales necesarios
1. Tubos de PCR y otros materiales relacionados.
2. Cebadores específicos para qPCR y plantillas de ADN.
3. Placa de 96 pocillos para qPCR y membrana de sellado (película adhesiva).
Notas
1. La premezcla SYBR Green qPCR debe descongelarse completamente antes de su uso. Protéjala de la luz directa y guárdela en la oscuridad.
2. La premezcla SYBR Green qPCR contiene glicerol. Mezcle suavemente antes de usar para evitar la formación de burbujas; agite en vórtex y centrifugue antes de usar. Almacene inmediatamente a -20 °C después de su uso.
3. Este producto contiene ADN polimerasa. Mantener en hielo durante su uso. Para usos repetidos a corto plazo en un mismo día, se permite el almacenamiento temporal a 4 °C. Minimizar los ciclos de congelación y descongelación.
Instrucciones
1. Preparación experimental
1. Se recomienda elegir una longitud del producto de amplificación dentro del rango de 70-200 pb.
2. Se recomienda tomar un volumen de reacción de 20 μL, agregar 1 pg-50 ng de ADN como plantilla y configurar NTC (Control sin plantilla).
3. Para garantizar la precisión experimental, realice réplicas técnicas por triplicado para todas las muestras y controles.
2. qPCR RreacciónSistema
| Componentes | Volumen |
| Premezcla SYBR Green qPCR | 10 µL |
| Cebador directo (10 µM)* | 0,4 µL |
| Cebador inverso (10 μM)* | 0,4 µL |
| ADN genómico o ADNc** | 2 µL |
| ddH2EL | Hasta 20 µL |
Por lo general, la concentración final del cebador es de 0,2 μM, obteniéndose buenos resultados. Como referencia, se puede utilizar una concentración final de 0,1 a 1,0 μM para establecer el rango. En caso de baja eficiencia de amplificación, se puede aumentar la concentración de los cebadores. Si se producen reacciones no específicas, se puede reducir la concentración de los cebadores y optimizar el sistema de reacción.
**Utilizando 10 pg-10 ng de ADN genómico o 10 pg-100 ng de ADNc como cantidad de referencia de plantilla, se puede realizar una dilución en gradiente de la plantilla para determinar su uso óptimo debido a los diferentes números de copias de los genes objetivo contenidos en las plantillas de diferentes especies. Además, cuando se utiliza ADNc (solución de reacción de RT) de la reacción de RT qPCR de dos pasos como plantilla, la cantidad añadida no debe exceder el 10 % del sistema de reacción de qPCR.
3. qPCR RPrograma de reacción
| Paso | Temperatura | Tiempo | Ciclos |
| Predesnaturalización | 95 ℃ | 3 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 5 s | 40-45 |
| Recocido y extensión | 60℃ | 30-34 años* | |
| Curva de fusión | Instrumento predeterminado | / | 1 |
* Confirme que se realiza una adquisición de señal después de cada paso de extensión. El tiempo de extensión varía según la máquina: 30 s para StepOne Plus, 31 s para 7300 y 34 s para 7500. Si no se especifica lo contrario, se utilizará el valor predeterminado de 30 s.
Datos Análisis
1. Grafique la curva estándar en función de los valores de Ct y la cantidad de muestra. El coeficiente de correlación (R²) de la curva estándar debe ser >0,98, con una pendiente entre -3 y -3,5. La eficiencia de amplificación por PCR (E) generalmente se sitúa entre el 90 % y el 120 %.
2. La desviación estándar (DE) de los valores de Ct entre pozos replicados debe ser
3. La curva de fusión del producto de amplificación no muestra productos de amplificación no específicos significativos (picos no específicos) ni picos de dímeros de cebadores (confirmar mediante electroforesis en gel de agarosa si es necesario). Además, el valor de Tm de la curva de fusión suele estar entre 80 y 95 °C.
4. Validación de Ct válido: Un valor de Ct de amplificación válido debe ser menor que el valor de Ct de la curva de control sin plantilla, mientras que su curva de fusión no debe mostrar picos no específicos.