ARN polimerasa T7 (termoestable)--HYJ213
La ARN polimerasa T7 (termoestable) es adecuada para la transcripción in vitro a temperaturas elevadas. Utilizando una plantilla de ADN bicatenario lineal que contiene la secuencia promotora T7 y NTP como sustratos, transcribe la secuencia de ADN posterior al promotor para producir ARN. Esta enzima también puede incorporar nucleótidos modificados para producir ARN marcado con biotina, colorante o isótopos radiactivos, o utilizar estructuras de capping o análogos para producir ARN con capping. La reacción a alta temperatura ayuda a reducir la formación de subproductos de ARN bicatenario y minimiza la inmunogenicidad del ARN resultante.
Componentes
| Componentes | 5KU | 50KU | 500 KU | 5000KU |
| ARN polimerasa T7 (termoestable) 50 U/μL | 0,1 mL | 1 mL | 10 ml | 100 ml |
| 10×Buffer IVT de alto rendimiento A | 2 × 0,1 mL | 2 × 1 mL | 2 × 10 mL | 2 × 100 mL |
Almacenamiento
Transportar a temperaturas inferiores a 0 °C; almacenar entre -25 y -15 °C. Válido durante 24 meses.
Búfer de almacenamiento
50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 20 mM β-ME, 1 mM EDTA, 50 % glicerol, 0,1 % (p/v) Triton X-100, pH 7,9 a 25 °C
Sistema de reacción y condiciones
| Componentes | Volumen |
| 10×Buffer IVT de alto rendimiento A | 2 µL |
| ATP/GTP/CTP/UTP (100 mM de cada uno) | 2 μL cada uno (10 mM cada uno, concentración final)* |
| inhibidores de la RNasa | 1 μL (40 U) |
| Pirofosfatasa inorgánica | 0,5 μL (0,05 U) |
| ARN polimerasa T7 (dsRNA bajo) 50 U/μL | 1 μL |
| ADN molde linealizado | 1 μg |
| agua libre de nucleasas | Hasta 20 µL |
Añade los componentes de la reacción en el orden indicado anteriormente.
Tiempo de reacción: 37 °C durante 2 horas, o 50 ℃ durante 1 hora si se requiere una reacción a alta temperatura.
Reacción de terminación:Añadir 2 µL de EDTA 0,2 M (pH = 8,0 a 25 °C)
Eliminación de la plantilla de ADN: La plantilla de ADN se puede eliminar con 10 U de DNasa I e incubación durante 30 minutos a 37 °C.
Notas
- La reacción de transcripción debe realizarse en un entorno libre de contaminación por RNasa. Se recomienda usar guantes. Las puntas, los tubos y el agua deben estar libres de nucleasas.
- La eficiencia de la transcripción varía según las diferentes secuencias, y se pueden realizar ajustes de gradiente en el sistema de reacción.
- La mezcla de reacción para la síntesis de ARN debe prepararse a temperatura ambiente, ya que el ADN puede precipitar en presencia de 10×Hi-Yield IVT Buffer A a 4 °C.
- El rendimiento de transcripciones de la longitud adecuada disminuye si el ADN molde no está completamente linealizado.
- La mezcla de reacción se puede escalar hacia arriba o hacia abajo.
- Los fragmentos transcritos tienen un tamaño igual o inferior a 500 pb, por lo que se recomienda ampliar el tiempo de transcripción a 4-8 horas.
- Tras congelar y descongelar la solución tampón IVT A de alto rendimiento 10×, es fácil encontrar precipitados. Por favor, compruebe que la solución se haya disuelto completamente antes del experimento. Si los precipitados son difíciles de disolver, vuelva a disolver la solución tampón IVT A de alto rendimiento 10× a 37 °C.