Kit de prueba universal para la detección de proteína A residual-HYI135
Este kit de ensayo se utiliza para detectar proteína A residual en anticuerpos y proteínas de fusión Fc. El principio de este kit se basa en un inmunoensayo tipo sándwich, que utiliza un tampón ácido para diluir la muestra y separar eficazmente la proteína A residual de la porción Fc de la muestra, y los pasos involucrados son simples. Como se muestra en la Figura 1, la placa de ensayo proporcionada en el kit está pre-recubierta con mAb anti-proteína A. La serie de estándares y muestras de proteína A diluidos en ácido se agregan directamente a la placa de ensayo pre-recubierta. Después de la incubación a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora, las sustancias no unidas se eliminan mediante lavado, lo que resulta en la formación de un complejo "anticuerpo recubierto-proteína A" en la placa de ensayo. Posteriormente, se agregan anticuerpos de detección anti-proteína A biotinilados, formando un complejo "anticuerpo recubierto-proteína A-anticuerpo de detección biotinilado". Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, las sustancias no unidas se eliminan mediante lavado. A continuación, se añade el complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (SA-HRP) y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos, lo que da lugar a la formación de un complejo de "anticuerpo recubierto-proteína A-anticuerpo de detección biotinilado-SA-HRP" en la placa de ensayo. Tras lavar las sustancias no unidas, se añade el sustrato TMB. La reacción enzimática del sustrato en la fase sólida genera una reacción de color. Tras aproximadamente 6 minutos de desarrollo del color, la reacción se detiene. Los resultados se miden utilizando un lector ELISA a longitudes de onda de 450 nm, con 650 nm como longitud de onda de referencia. Los resultados se calculan utilizando la diferencia entre OD450nm y OD650nm, que refleja indirectamente la cantidad de proteína A unida a la placa de ensayo. La cantidad residual de proteína A en los anticuerpos y las proteínas de fusión Fc se puede analizar cuantitativamente basándose en la curva estándar.
Características del kit
1. Tanto los anticuerpos recubiertos como los de detección son anticuerpos monoclonales producidos a partir de líneas celulares monoclonales. Se purifican mediante un proceso de cromatografía en columna de dos pasos, lo que garantiza la consistencia entre lotes y el suministro sostenible del kit de ensayo. Las regiones Fc y las regiones de estructura de ambos anticuerpos no se unen a la proteína A, lo que garantiza la validez científica del principio de diseño del kit de ensayo.
2. El kit incluye un ligando universal de proteína A. Cuando se utiliza como estándar, se ha validado que este ligando ofrece buenos índices de recuperación para diversos ligandos en muestras reales, lo que demuestra la versatilidad del kit para múltiples ligandos de proteína A, tanto importados como nacionales. Además, el kit incluye cuatro ligandos de proteína A importados y cuatro nacionales de uso común en la industria. Los usuarios pueden seleccionar el ligando correspondiente como estándar para las pruebas según sus necesidades. Si se utiliza un estándar de proteína A no incluido en el kit, este puede diluirse y prepararse siguiendo los pasos de la sección 6.2 (10) de este manual. Se están llevando a cabo investigaciones sobre otros ligandos de proteína A, los cuales se incluirán en el kit si es necesario tras su evaluación.
3. El procedimiento experimental es sencillo y solo requiere la dilución de la muestra y su adición directa a la placa. No implica pasos complejos como calentamiento, desnaturalización, centrifugación o preincubación antes de la dilución y adición de la muestra a la placa. Todo el proceso experimental dura aproximadamente 3 horas.
4. El kit ofrece una alta sensibilidad en comparación con otros productos similares. El punto más bajo de la curva estándar sirve como límite de cuantificación (10 pg/mL). El bajo límite de cuantificación garantiza a los usuarios un alto grado de flexibilidad y selectividad en el diseño experimental. Dependiendo de la cantidad residual real de Proteína A en la muestra de prueba, esta puede diluirse a 1-0,01 mg/mL, lo que corresponde a un límite de cuantificación final de 0,01-1 ppm. La relación de DO entre 10 pg/mL y 0 pg/mL en la curva estándar no es inferior a 2 veces, lo que garantiza la estabilidad y precisión de los datos de medición experimentales cuando el contenido de Proteína A en la muestra está cerca del límite de cuantificación. Es importante señalar que el límite de cuantificación se refiere al límite de cuantificación en una muestra específica con un protocolo específico. El límite de cuantificación del kit se obtiene mediante validación metodológica en muestras representativas. Al utilizar este kit, los usuarios no deben adoptar directamente el límite de cuantificación de 10 pg/mL, sino que deben desarrollar un plan de validación metodológica basado en las características de su propia muestra y las necesidades de especificación, y establecer un límite de cuantificación razonable de acuerdo con los resultados de la validación metodológica.
5. El kit ha sido sometido a una validación metodológica exhaustiva y rigurosa según la última versión de ICH-Q2 (R2). Se ha validado su exactitud, precisión, linealidad, límite de cuantificación, especificidad y otros parámetros, cumpliendo con los requisitos reglamentarios para la detección de proteína A residual en anticuerpos y fármacos con proteína de fusión Fc en diversos países. El kit incluye un protocolo de validación recomendado, pero los usuarios también pueden diseñar su propio plan de validación según sus necesidades específicas.
El kit demuestra una buena estabilidad. Tras un mes de almacenamiento a 37 °C, no se observan cambios significativos en su rendimiento. Actualmente se está realizando una evaluación de la estabilidad a largo plazo a temperatura ambiente. Si bien el kit se puede transportar a temperatura ambiente, se recomienda almacenarlo entre 2 y 8 °C para su conservación a largo plazo.
Componentes
| Reactivo | Presupuesto | Descripción |
| Placa pre-recubierta con anticuerpos anti-proteína A | 8 pozos × 12 tiras * 1 plato | Removible, recubierto con mAb cuyo Fc no se une a la proteína A. |
| Estándares universales de proteína A | 128 ng/mL 120 μL/vial | Seleccione el estándar correspondiente en función de la muestra que se esté analizando; Diluir con "1× Wash Buffer 1" a 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10 pg/mL. |
| Estándar 1: MabSelect SuRe(Cytiva) | ||
| Estándar 2: MabSelect PrismA (Cytiva) | ||
| Estándar 3: TOYOPEARL AF-rProteína A(HC)-650F(Tosoh) | ||
| Estándar 4: Eshmuno A (Merck) | ||
| Estándar 5: NMab Pro (NanoMicro) | ||
| Estándar 6: UniMab 50HC, NMab (NanoMicro) | ||
| Estándar 7: MabPurixTMA/P(Sepax) | ||
| Estándar 9: Maxtar® ARPA (BioLink) | ||
| Tampón de lavado 1 | 50 ml/botella (10×) | Diluir con agua desionizada como una solución 1× para usarla como tampón de dilución para estándares y muestras de proteína A, y como tampón de lavado en el primer paso. |
| Anticuerpo de detección marcado con biotina | 150 μL/vial(100×) | mAb con subtipo Fc que no se une a la proteína A; diluir con "Diluyente de anticuerpos de detección y SA-HRP" para 1 uso. |
| SA-HRP | 150 μL/vial(100×) | Diluir con "Diluyente para anticuerpos de detección y SA-HRP" para un solo uso. |
| Anticuerpo de detección y diluyente SA-HRP | 30 ml/frasco (1×) | Se utiliza para diluir "marcado con biotina" Anticuerpo de detección" y "SA-HRP" |
| Tampón de lavado 2 | 30 mL/frasco (10×) | Diluir con agua desionizada como una solución 1× para usarla como tampón de lavado en el segundo y tercer paso. |
| Solución de sustrato TMB | 12 ml/frasco (1×) | Solución que contiene 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina (TMB) y H2EL2; utilizado directamente. |
| Solución de parada | 8 ml/frasco (1×) | Solución ácida, utilizada directamente |
| Película de sellado de placas | 1 pieza | / |
Notas: 1. El estándar 8 para el ligando NGL-ImpactTM A (n.° PA-STD-NGL) no está incluido en este kit.
Póngase en contacto con nosotros si lo necesita.
2. Para satisfacer la demanda del mercado, la empresa seguirá introduciendo estándares de proteína A más específicos, cada uno con su propio número de producto, los cuales no están incluidos en los kits. Si los necesita, póngase en contacto con la empresa por separado.
3. Puede producirse cristalización en el tampón de lavado 1 (10×) y en el tampón de lavado 2 (10×). Se puede calentar y disolver en un baño de agua a 40℃-50℃ y se puede almacenar a temperatura ambiente durante tres meses.
Sfuria
El kit de ensayo debe almacenarse a una temperatura de entre 2 y 8 °C, y su vida útil en estas condiciones es de 3 años.
Otros reactivos y materiales necesarios (no incluidos en el kit)
- agua desionizada
- Depósito de muestras
- Papel absorbente
- Puntas de pipeta de baja adherencia con volúmenes que van desde 5 a 1000 μL.
- Placa de dilución de muestras de baja unión
- Tubos de centrífuga de polipropileno (por ejemplo, de 1,5 ml, 2 ml, 5 ml y 15 ml) para la dilución de muestras o la preparación de anticuerpos de detección.
- Pipeta monocanal con rango de ajuste de volumen de 5-300 μL y 300-1000 μL, respectivamente.
- Pipeta multicanal con rango de ajuste de volumen de 5 a 300 μL.
- Frascos volumétricos adecuados para contener "1× Wash Buffer 1" y "1× Wash Buffer 2".
- Lector de microplacas capaz de leer la absorbancia a 450 nm (obligatorio) y 650 nm.
- Agitador de microplacas (200-500 rpm)
- Software capaz de ajustar curvas de cuatro parámetros (también puede utilizar Microsoft Excel para la representación gráfica).