Transcriptasa inversa II de inicio en caliente (sin glicerol) HYA214
La transcriptasa inversa de inicio en caliente II es una transcriptasa inversa altamente activa obtenida mediante transformación dirigida por plataforma de selección racional basada en la transcriptasa inversa de inicio en caliente. Esta enzima ha eliminado la actividad de la RNasa H y presenta una mayor tolerancia a la temperatura. Este producto ha sido modificado mediante el método de inicio en caliente para bloquear la actividad de la transcriptasa inversa a temperatura ambiente, lo que elimina eficazmente los efectos adversos de la estructura avanzada del ARN y los factores inespecíficos sobre la síntesis de ADNc, y le confiere mayor estabilidad y capacidad de síntesis de transcripción inversa.
Componentes
1. 200 U/µL de transcriptasa inversa II de arranque en caliente
2. Tampón de transcriptasa inversa 5×WS (opcional)
*El tampón de transcriptasa inversa 5×WS no contiene dNTPs. Por favor, añada dNTPs al preparar el sistema de reacción.
Almacenamiento
Almacenar entre -25°C y -15°C.
Definición de unidad
1 unidad de actividad (U) se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 nmol de dTTP en sustancias insolubles en ácido a 37 °C durante 10 min utilizando Poly (A)·Oligo (dT).25como plantilla/instructora.
Instrucciones
1. Consulte la tabla a continuación para preparar el sistema.
| Componentes | Volumen |
| ARN molde | ARN total ≤ 5 µg; ARNm ≤ 1 µg |
| Oligo(dT)12-18 Primer* | 50 pmol |
| OPrimer aleatorio * | 50 pmol (20~100 pmol) |
| OCebador específico del gen * | 2 pmol |
| dNTPs (10 mM cada uno) | 1 μL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 10 μL |
*Elija diferentes tipos de cebadores según las necesidades experimentales.
2. Calentar a 65℃ durante 5 minutos y enfriar rápidamente sobre hielo durante 2 minutos;
3. Añada los siguientes componentes al sistema anterior hasta alcanzar un volumen total de 20 µL y mezcle suavemente.
| Componentes | Volumen |
| Tampón de transcriptasa inversa 5×WS | 4 µL |
| 200 U/µL Transcriptasa inversa II de arranque en caliente | 1 µL |
| Inhibidor de RNasa 40 U/µL | 1 µL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 20 μL |
4. Realice la reacción bajo las siguientes condiciones.
1) Si se utiliza Random Primer, incubar primero a 25℃ durante 10 min; luego incubar a 50℃ durante 30~60 min;
2) Si se utiliza Oligo dT o cebadores específicos, incubar a 50℃ durante 30~60 min.
5. Inactive la transcriptasa inversa II de inicio en caliente calentándola a 95℃ durante 5 minutos y finalice la reacción.
6. El producto de transcripción inversa se puede utilizar directamente para la reacción de PCR y la reacción de PCR en tiempo real, o almacenarse a -20℃ durante un largo período de tiempo.
Descripción técnica
1. Adecuado para la optimización de la temperatura de transcripción inversa en el rango de 42℃~55℃.
2. Gracias a su mayor estabilidad, es adecuado para la amplificación por transcripción inversa a alta temperatura, lo que facilita su paso eficaz a través de la compleja estructura del ARN y resulta idóneo para la detección mediante RT-PCR cuantitativa por fluorescencia multiplex en un solo paso.
3. Presenta buena compatibilidad con diversas enzimas de amplificación por PCR y es adecuado para reacciones de RT-PCR de alta sensibilidad.
4. Es adecuado para la construcción de bibliotecas de ADNc.
5. Carrera de 3' y 5'.