Transcriptasa inversa RTL de inicio en caliente (sin glicerol) HYB214
La transcriptasa inversa Warm Start RTL es una ADN polimerasa dependiente de ARN modificada con aptámeros, cuya actividad de retrotranscripción se inhibe por debajo de 40 °C. RTL carece de actividad exonucleasa 3' → 5' y posee actividad RNasa H. Puede utilizar ARN como molde para sintetizar una cadena de ADN complementaria y se puede aplicar a la síntesis de ADNc de primera cadena. Debido a su alta actividad entre 50 y 65 °C, es particularmente adecuada para RT-LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucles). Dado que la actividad polimerasa de WS RTL se inhibe por debajo de 40 °C, puede reducir significativamente la amplificación inespecífica causada por el apareamiento incorrecto de los cebadores durante la preparación del sistema de reacción, resolver el problema de los dímeros de cebadores que se generan fácilmente antes de la reacción en el sistema, mejorar la consistencia y especificidad de la amplificación, y permitir aplicaciones de alto rendimiento y operación a temperatura ambiente. WS RTL (sin glicerol) se puede utilizar para preparar preparados liofilizados, reactivos RT-LAMP liofilizables, etc.
Componentes
| Componentes | 1500 U | 15000EN | 150000EN |
| Transcriptasa inversa RTL de inicio en caliente (sin glicerol) (15 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| búfer RTL 10×HH | 1,5 ml | 4 x 1,5 mL | 5×10 ml |
| MgSO4(100 mM) | 1,5 ml | 2 x 1,5 mL | 3×10 ml |
Almacenamiento
Conservar entre -25 y -15 °C. Válido durante 18 meses.
Definición de unidad
Una unidad incorpora 1 nmol de dTTP en material precipitable con ácido en 20 minutos a 50 °C utilizando poli(A)•oligo(dT)25 como plantilla-cebador.
Control de calidad
1. Actividad residual de la endonucleasa: Una reacción de 50 µL que contiene 1 µg de λDNA y 15 unidades de RTL, incubada durante 16 horas a 37ºC, muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
2. Actividad residual de la exonucleasa: Una reacción de 50 µL que contiene 1 µg de ADN λ digerido con Hind III y 15 unidades de RTL, incubada durante 4 horas a 37 °C, muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
3. Actividad residual de la nickasa: Una reacción de 50 µL que contiene 1 µg de pBR322 superenrollado y 15 unidades de RTL incubada durante 4 horas a 37ºC muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
4. Actividad residual de la RNasa: Una reacción de 10 µL que contiene 0,48 µg de ARN MS2 y 15 unidades de RTL incubada durante 4 horas a 37ºC muestra el mismo patrón que el control negativo mediante electroforesis en gel.
5. E. coliADN genómico:Medido con E. colikits de detección de HCD específicos, 15 unidades de RTL contienen menos de 1 E. coli genoma.
Sistema de reacción de transcripción inversa
| Componente | Volumen |
| ARN molde | opcional |
| Oligo(dT)18~25 (50 μM) o mezcla de cebadores aleatorios (60 μM) | 2 μL |
| Mezcla de dNTP (10 mM de cada uno) | 1 μL |
| Inhibidor de la ARNasa (40 U/μL) | 0,5 μL |
| Transcriptasa inversa RTL de inicio en caliente (sin glicerol) (15 U/μL) | 0,5 μL |
| 10 búferes HH RTL | 2 μL |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 20 μL |
Nota: La dosis recomendada de ARN total es de 1 ng a 1 μg. La dosis recomendada de ARNm es de 50 ng a 100 ng.
Programa de reacción
| Temperatura | Tiempo |
| 25 ºC* | 5 minutos |
| 55 ºC | 10 minutos** |
| 80 ºC | 10 minutos |
*Si se utiliza Random Primer Mix, se requiere un paso de incubación a 25 °C.
**Si se utiliza la mezcla de cebadores objetivo, se requiere un paso de incubación a 55 °C durante 10 a 30 minutos.
Sistema de reacción RT-LAMP
| Componente | Volumen | Concentración final |
| ARN molde* | opcional | ≥10 copias |
| Mezcla de dNTP (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| Cebadores FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Cebadores F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Cebadores LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibidor de la ARNasa (40 U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Rxn |
| Transcriptasa inversa RTL de inicio en caliente (sin glicerol) (15 U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U |
| ADN polimerasa Bst 2.0 (8 U/μL) | 1 μL | 8 U |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10 búferes HH RTL / 10 búferes HH Bst 2.0 | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Agua libre de nucleasas | Hasta 25 μL | - |
Mezclar mediante agitación en vórtex y centrifugar brevemente para recoger la muestra. Incubar a temperatura constante entre 60 °C y 65 °C durante 1 hora.
Notas
1. Este producto se solidificará en color blanco al almacenarse a -20 °C. Sáquelo de la nevera y colóquelo en hielo durante unos 10 minutos. Una vez descongelado, puede utilizarse agitándolo y mezclándolo.
2. El producto de ADNc se puede almacenar a -20 °C o -80 °C o utilizarse inmediatamente para la reacción de PCR.
3. Para evitar la contaminación por RNasa, mantenga limpia el área experimental y use guantes y mascarillas limpios durante la operación.