2× MegaPfu Premix HYA448
Le prémélange 2× MegaPfu est un prémélange PCR haute fidélité prêt à l'emploi contenant la polymérase d'ADN MegaPfu, un tampon, un mélange de dNTP et un stabilisateur. Son utilisation est simple : il suffit d'ajouter les matrices et les amorces à la solution pour réaliser les réactions PCR, ce qui simplifie considérablement le processus et réduit les risques de contamination. La polymérase d'ADN MegaPfu présente une activité polymérase dans le sens 5'→3' et une activité exonucléase dans le sens 3'→5'. Elle corrige les mésappariements de bases générés lors de l'amplification de l'ADN et permet une réaction PCR rapide et haute fidélité. Le produit PCR amplifié avec ce prémélange possède des extrémités franches. En cas de clonage TA, il est nécessaire de traiter l'ADN avec de l'adénine (A) avant de l'insérer dans le vecteur T.
Composants
| Composants | Taille-1 | Taille 2 | Taille 3 |
| 2× MegaPfu Premix | 1 mL | 1 mL×5 | 1 mL × 15 |
Stockage
À conserver à -20°C.
Instructions
1. Système réactionnel
| Composants | Volume |
| 2× MegaPfu Premix | 25 µL |
| Amorce directe (10 μM) | 2 µL |
| Amorce inverse (10 μM) | 2 µL |
| Modèle d'ADN* | Variable |
| ddH2LE | Jusqu'à 50 µL |
*Différentes sources ou types de matrices nécessitent des concentrations de réaction différentes. Le tableau suivant présente l'utilisation recommandée de la matrice pour un système réactionnel de 50 µl :
| ADN | Montant d'entrée |
| ADN génomique des plantes, des animaux et de l'humain | 0,1-1 µg |
| ADN génomique d'E. coli | 10 à 100 de |
| ADNc | 1 à 5 μL (pas plus de 1/10 du volume total de la réaction PCR) |
| ADN plasmidique | 0,1-10 de |
| ADN λ | 0,5-10 de |
2. Programme de réaction
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Dénaturation initiale | 95 °C | 2 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 15 s | 30-35 |
| recuit | 56 °C | 15 s | |
| Extension | 72℃ | 30 s/ko | |
| Prolongation finale | 72℃ | 5 min | 1 |
| Prise | 4-12 °C | - | 1 |
Remarque : La température d'hybridation doit être ajustée en fonction de la teneur réelle en GC de l'amorce et de la matrice ; si nécessaire, un gradient de température peut être défini pour trouver la température optimale de liaison amorce-matrice.