Prémélange 5X One Step SYBR Green RT-qPCR HYA415
Le prémélange SYBR Green RT-qPCR One Step est destiné à être utilisé avec le SYBR Green I pour la PCR en temps réel. Ce produit est utilisé dans la méthode de PCR quantitative fluorescente en une étape (One Step), un processus à contre-courant au sein de la même zone, évitant ainsi le développement de nouvelles réactions, pour une efficacité optimale et une prévention de la contamination. Ce produit contient une RTase H active et inactivée par la chaleur grâce à un nouveau type de temps de réaction, ce qui permet d'obtenir un temps de réaction plus court et une efficacité de PCR accrue. Il est particulièrement adapté aux modèles d'ARN à faible concentration, offrant une sensibilité élevée. Cette étude présente une formulation spécifique, optimisée pour la qPCR, ainsi qu'un tampon amélioré pour la qPCR. Ce prémélange a été proposé par de nombreux fabricants de tests de PCR quantitative fluorescente, tels que Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad et Roche.
Composants
1. Mélange RTase 25× (SYBR qRT-PCR)
2. Tampon prémélangé RT 5× (SYBR qRT-PCR)
Stockage
Ce produit doit être conservé à l'abri de la lumière à -20℃ pour un stockage à long terme et à 4℃ pendant 3 mois.
Instructions
1. qRT-PCR RréactionSystème
| Composants | 25 µL Volume | 50 µL Volume | Concentration finale |
| Tampon prémélangé RT 5 × (SYBR qRT-PCR) | 5 µL | 10 µL | 1× |
| Mélange RTase 25× (SYBR qRT-PCR) | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mélange d'apprêt 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Modèle d'ARN** | - | - | - |
| DEPC H2LE | Jusqu'à 25 µL | Jusqu'à 50 µL | - |
*En général, une concentration finale d'amorce de 0,2 μM permet d'obtenir de bons résultats ; lorsque les performances de la réaction sont médiocres, la concentration d'amorce peut être ajustée dans la plage de 0,2 à 1 μM.
**La quantité recommandée de matrice d'ARN à ajouter est comprise entre 10 pg et 100 ng.
2. qRT-PCR RProgramme d'action
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50 °C | 10-20 min | 1 |
| Prédénaturation | 95 °C | 5 à 10 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10-20 s | 40-50 |
| Recuit et extension | 50-64℃ | 20-60 s | |
| Courbe de fusion | Par défaut de l'instrument | / | 1 |
* Vérifiez qu'une étape de collecte de signal est effectuée après chaque étape d'extension. La durée de cette étape varie selon les machines : 30 s pour StepOne Plus, 31 s pour 7300 et 34 s pour 7500. Sauf indication contraire, la durée par défaut est de 30 s.
Technique Information
1. Le système est généralement utilisé à 50℃, la température peut être améliorée entre 42℃ et 55℃, et cette amélioration peut être obtenue en 5 à 30 minutes.
2. La RTase utilisée dans le système de texte est la modification de base M-MLV, a une tolérance à la température plus élevée et une température d'inversion plus élevée, et a une efficacité d'inversion plus élevée.
3. Le système présente une bonne définition, une bonne compatibilité, et est très adapté à la pathogénicité et à l'organisation de l'ARN. Il convient d'ajouter un modèle au test ; d'utiliser un modèle à faible puissance pour en accroître encore l'efficacité, puis d'utiliser un test moléculaire à haute sensibilité.
4. La méthode en trois étapes pour augmenter la température d'extinction à une longueur inférieure ou supérieure à 200 bp.
5. Avant et après utilisation, le dispositif de transfert de liquide doit être utilisé et la procédure d'utilisation du tube PCR doit être constamment mise à jour ; après la fin de la réaction PCR, le tube ne doit pas être ouvert afin de réduire au maximum la contamination du sol.