Phosphatase alcaline--HYJ238
Ce kit utilise le principe de la méthode sandwich à double anticorps pour la détection quantitative de la pyrophosphatase inorganique dans les échantillons. La microplaque est pré-enduite d'anticorps anti-pyrophosphatase inorganique. La pyrophosphatase inorganique présente dans l'échantillon se lie aux anticorps immobilisés sur les puits. Un anticorps marqué à la peroxydase de raifort (HRP) est ensuite ajouté ; il se lie spécifiquement à la pyrophosphatase inorganique de l'échantillon, formant un complexe anticorps-antigène-anticorps marqué à l'enzyme. Après l'ajout de la solution de substrat TMB, la HRP catalyse la réaction du substrat en un produit bleu, qui vire au jaune après l'ajout d'une solution d'arrêt acide. L'intensité de la coloration jaune est directement proportionnelle à la concentration de pyrophosphatase inorganique dans l'échantillon. L'absorbance (DO) est mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques, et la concentration de pyrophosphatase inorganique dans l'échantillon est calculée à partir d'une courbe d'étalonnage.
Composants
| Composants | 48T | 96T |
| Microplaque ELISA | 8×6 | 8×12 |
| Conjugué enzymatique (100×) | 60 µL | 120 µL |
| Tampon de dilution | 15 mL | 30 mL |
| solution de substrat TMB | 6 mL | 12 mL |
| Solution d'arrêt | 3 mL | 6 mL |
| Tampon de lavage concentré (10x) | 15 mL | 30 mL |
| Standard (0,1 mg/mL) | 25 µL | 50 µL |
| Scelleuse de plaques | 2 pièces | 4 pièces |
Stockage
- La solution étalon (0,1 mg/mL) du kit doit être conservée entre -25 et -15 °C, tandis que les autres composants doivent être conservés entre 2 et 8 °C. Pour garantir la stabilité du stockage, éviter toute exposition à une forte lumière. La durée de conservation est de 12 mois.
- Pour les kits usagés : une fois la microplaque ouverte, veuillez recouvrir les puits non utilisés avec le film étirable et remettre le kit dans le sachet aluminium contenant le sachet déshydratant. Refermez hermétiquement le sachet et conservez-le à une température de 2 à 8 °C dès que possible après utilisation. Les autres réactifs doivent également être conservés à une température de 2 à 8 °C dès que possible après utilisation.
Matériaux nécessaires mais non fournis
- Lecteur de microplaques avec filtre 450±10 nm (idéalement capable de détecter aux longueurs d'onde de 450 et 650 nm).
- Agitateur de microplaques.
Instructions
Avant de commencer
1. Avant utilisation, amener tous les composants du kit et les échantillons à température ambiante (18-25 °C). Si le kit n'est pas utilisé en une seule fois, veuillez ne prélever que les bandelettes et les réactifs nécessaires à l'expérience en cours et conserver les autres bandelettes et réactifs dans les conditions requises.
2. Tampon de lavage : diluer 30 mL de tampon de lavage concentré 10× avec 270 mL d'eau déionisée ou distillée pour préparer 300 mL de tampon de lavage 1×.
3. Solution étalon : Diluer la solution étalon concentrée (0,1 mg/mL) avec le tampon de dilution aux concentrations suivantes : 4 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0,5 ng/mL, 0,25 ng/mL, 0,125 ng/mL, 0,0625 ng/mL et 0 ng/mL. Nous recommandons de suivre le tableau de dilution ci-dessous :
| Non. | Concentration finale (pg/μL) | Instructions de dilution | |
| tampon STE | Standard | ||
| 1000 | 198 µL | 2 μL 0,1 mg/mL standard | |
| UN | 4 | 498 µL | 2 μL 1000 ng/mL |
| B | 2 | 250 µL | 250 μL de solution A |
| C | 1 | 250 µL | 250 μL de solution B |
| D | 0,5 | 250 µL | 250 μL de solution C |
| ET | 0,25 | 250 µL | 250 μL de solution D |
| F | 0,125 | 250 µL | 250 μL de solution E |
| G | 0,0625 | 250 µL | 250 μL de solution F |
| H | 0 | 250 µL | / |
4. Solution de travail du conjugué enzymatique : centrifuger brièvement la solution mère avant utilisation. Diluer à la concentration de travail avec le tampon de dilution.
5. Sous-état TMB : aspirer la dose nécessaire de solution à l’aide d’embouts stérilisés et ne pas remettre la solution résiduelle dans le flacon. TMB
Le substrat est sensible à la lumière, ne pas exposer le substrat TMB à la lumière pendant une période prolongée.* 1 pmol d'extrémités d'ADN correspond à environ 1 µg d'un plasmide de 3 kb.
Tampon de réaction 10× : 500 mM de chlorhydrate de bis-tris-propane (pH 6,0, 25 °C), 10 mM de MgCl₂21 mM ZnCl2
1. Incuber à 37°C pendant 30 minutes.
2. Arrêter la réaction par inactivation thermique à 70 °C pendant 5 minutes.
Notes
- Le système de réaction peut être adapté à la hausse ou à la baisse en fonction des besoins expérimentaux.
- L'enzyme est un dimère homologue, et le poids moléculaire de son monomère est de 35 kDa.
- Il est indispensable d'impliquer le Zn2+ dans le processus de réaction puisqu'il s'agit d'un Zn2+ ou Mg2+ enzyme dépendante.
- Pour votre sécurité, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant l'opération.