Prémélange RT-qPCR SYBR Green One Step HYA416
Le kit One Step SYBR Green RT-qPCR Premix est conçu pour la réaction RT-qPCR utilisant l'ARN comme matrice. La transcription inverse et la PCR quantitative sont réalisées dans le même tube, ce qui simplifie l'utilisation et réduit les risques de contamination. Ce kit utilise une transcriptase inverse de nouvelle génération (RTase) et une Taq polymérase à démarrage à chaud, modifiée par une méthode d'immunomarquage, et un tampon de réaction optimisé pour une quantification précise de l'ARN matrice. De plus, le tampon contient un colorant de référence passif ROX, compatible avec tous les modèles d'instruments qPCR. Il n'est pas nécessaire d'ajuster la concentration de ROX selon les modèles. Il suffit d'ajouter les amorces et la matrice lors de la préparation du système réactionnel pour l'amplification.
Composants
| Composants | 250T |
| 2 × tampon SYBR RT-qPCR* | 2 × 1,25 mL |
| Mélange enzymatique SYBR** | 2 × 125 μL |
| Eau sans nucléase | 3 × 1 mL |
*Les composants incluent déjà un mélange de dNTP et du magnésium.2+, colorant de référence passif ROX, etc.
**Le prémélange One Step SYBR Green RT-qPCR contient de la RTase, un inhibiteur de RNase et de la Taq ADN polymérase dans des proportions optimisées.
Stockage
Ce produit doit être conservé à -20℃ pour un stockage à long terme et doit être protégé de la lumière.
Instructions
1. qRT-PCR RréactionSystème
| Composants | Volume |
| 2 × tampon SYBR RT-qPCR | 10 µL |
| Mélange enzymatique SYBR | 1 µL |
| Amorce directe (10 μM)* | 0,4 µL |
| Amorce inverse (10 μM)* | 0,4 µL |
| Modèle d'ARN** | - |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 20 µL |
En règle générale, une concentration finale d'amorce de 0,2 μM dans le système réactionnel permet d'obtenir un bon effet d'amplification. Lorsque les performances de la réaction sont relativement faibles, la concentration d'amorce peut être ajustée entre 0,1 et 1,0 μM.
La précision de la quantité finale de matrice ajoutée lors de la mise en place du système réactionnel a un impact considérable sur les résultats quantitatifs. Il est donc recommandé d'ajouter la matrice au système réactionnel ultérieurement (par exemple, pour obtenir 2 à 5 μL par échantillon), ce qui améliore significativement la reproductibilité de l'expérience. Il est recommandé d'utiliser une quantité totale d'ARN de 1 pg à 1 μg.
2. qRT-PCR RProgramme d'action
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Transcription inverse* | 50 °C | 5 min | 1 |
| Prédénaturation** | 95 °C | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10 s | 40 |
| Recuit et extension | 60 °C | 30 s | |
| Courbe de fusion | Par défaut de l'instrument | / | 1 |
*Pour les matrices présentant des structures secondaires complexes ou des régions riches en GC, la température de transcription inverse peut être augmentée à 55 °C ou 60 °C, ce qui contribue à améliorer l'efficacité ultérieure ; et la durée de transcription inverse peut être prolongée à 15 minutes, ce qui contribue à augmenter le rendement en ADNc.
Cette condition de prédénaturation convient aux réactions existantes. Si la structure de la matrice est complexe, la durée de prédénaturation peut être portée à 3 minutes afin d'en améliorer l'efficacité.
Technique Information
1. Choix du diluant pour la matrice : Vous pouvez utiliser de l’eau sans nucléase du commerce, de l’eau DEPC ou de l’eau sans nucléase préparée au laboratoire pour diluer la matrice. La solution TE contient de l’EDTA, qui inhibe l’activité enzymatique, et ne peut donc pas être utilisée comme diluant.
2. Le mélange enzymatique SYBR contient une forte concentration de glycérol. Veuillez centrifuger brièvement avant utilisation, récupérer le surnageant au fond du tube à réaction et l'aspirer délicatement à l'aide d'une pipette. Mélangez soigneusement, puis aspirez le surnageant avec précision.
3. Lors de la conception des amorces, la longueur recommandée du produit PCR cible est de 80 à 150 pb. Les amorces qui n'ont pas été utilisées depuis longtemps doivent d'abord être testées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) afin de vérifier leur intégrité et d'exclure toute dégradation.
4. Si le contrôle négatif sans matrice présente une amplification manifeste, il convient d'envisager une contamination du système réactionnel et une contamination par aérosols dans l'environnement de préparation. Il est possible de remplacer le kit, l'eau et les amorces pour répéter l'expérience ; le système réactionnel doit être préparé sous une hotte à flux laminaire afin de réduire la contamination par aérosols.
5. Lorsque la courbe de fusion présente plusieurs pics, il faut envisager la possibilité que la matrice d'ARN contienne une contamination génomique, une amplification non spécifique, des dimères d'amorces, etc.
6. Si vous devez améliorer la spécificité de l'amplification, vous pouvez augmenter de manière appropriée la température d'hybridation (augmenter de 3°C à chaque fois).
7. Pour améliorer l'efficacité d'amplification, vous pouvez prolonger la durée d'extension du programme standard en deux étapes à 60 secondes ou utiliser le programme en trois étapes. Le programme d'amplification en deux étapes configure généralement l'acquisition du signal lors de l'étape d'extension de recuit à 60 °C ; le programme d'amplification en trois étapes doit configurer l'acquisition du signal lors de l'étape d'extension à 72 °C. Les paramètres du programme sont les suivants :
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50 °C | 5 min | 1 |
| Prédénaturation | 95 °C | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10 s | 40 |
| recuit | 56 °C | 30 s | |
| Extension | 72 °C | 30 s | |
| Courbe de fusion | Par défaut de l'instrument | / | 1 |