Mélange universel bleu SYBR Green rapide pour qPCR avec UDG HYA414
Ce réactif SYBR Green universel de couleur bleue facilite l'échantillonnage et utilise un colorant de référence spécialement conçu (ROX) pour une sensibilité et une résolution accrues. Il est compatible avec tous les modèles d'instruments de PCR quantitative en temps réel (qPCR) à fluorescence (y compris ceux nécessitant un ROX élevé, faible ou nul). Le réactif intègre un système dUTP/UDG qui prévient la contamination par le produit d'amplification et garantit la précision des résultats de la qPCR. L'UDG dégrade rapidement les polluants contenant de l'uranium à température ambiante et se désactive rapidement après prédénaturation à 95 °C, sans affecter l'efficacité ni la sensibilité de la qPCR. L'amplification est réalisée avec une ADN polymérase Taq à démarrage à chaud, ce qui renforce la spécificité du produit. En résumé, ce réactif constitue une solution fiable et polyvalente pour les expériences de qPCR basées sur le SYBR Green.
Composants
| Composants | 1 mL | 5 mL |
| Mélange universel bleu SYBR Green rapide pour qPCR avec UDG | 1 mL | 5 × 1 mL |
Instruments
Aucun colorant de référence supplémentaire n'est requis. Le mélange Blue Universal SYBR Green Fast qPCR Mix avec UDG convient à tous les instruments qPCR (y compris les appareils en mode ROX élevé, ROX faible et sans ROX requis).
Stockage
Ce produit doit être conservé à -20℃ pour un stockage à long terme et doit être protégé de la lumière.
Matériel requis
1. Tubes PCR et autres matériels connexes.
2. Amorce spécifique qPCR et matrices d'ADN.
3. Plaque qPCR 96 puits et membrane de scellage (film adhésif).
Notes
1. Mélange universel bleu SYBR Green Fast qPCR avec UDG, veuillez le décongeler avant utilisation, éviter l'exposition directe au soleil et le conserver dans un endroit sombre.
2. Le mélange Blue Universal SYBR Green Fast qPCR avec UDG contient du glycérol ; mélanger délicatement pour éviter la formation de bulles. Bien mélanger et centrifuger avant utilisation. Après utilisation, conserver immédiatement au réfrigérateur à -20 °C.
3. Ce produit contient de l'ADN polymérase ; veuillez donc le conserver sur glace lors de son utilisation. Après plusieurs utilisations rapprochées, il peut être conservé temporairement à 4 °C. Afin de préserver la qualité du produit, il est recommandé d'éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
Instructions
1. Préparation expérimentale
1. Il est recommandé de choisir la longueur du produit d'amplification dans la plage de 70 à 200 pb.
2. Il est recommandé de prendre un volume réactionnel de 20 μL, d'ajouter 1 pg-50 ng d'ADN comme matrice et de définir un NTC (contrôle sans matrice).
3. Pour garantir la précision expérimentale, effectuez des réplicats techniques en triple pour tous les échantillons et les contrôles.
2. qPCR RréactionSystème
| Composants | Volume |
| Mélange universel bleu SYBR Green rapide pour qPCR avec UDG | 10 µL |
| Amorce directe (10 µM)* | 0,4 µL |
| Amorce inverse (10 μM)* | 0,4 µL |
| Modèle d'ADN** | 2 µL |
| ddH2LE | Jusqu'à 20 µL |
En général, la concentration finale de l'amorce est de 0,2 μM, et de bons résultats sont obtenus. Une concentration finale de 0,1 à 1,0 μM peut servir de référence pour définir la plage de concentrations optimales. En cas de faible efficacité d'amplification, la concentration des amorces peut être augmentée. Si des réactions non spécifiques se produisent, la concentration des amorces peut être réduite et le système réactionnel optimisé.
En utilisant 10 pg à 10 ng d'ADN génomique ou 10 pg à 100 ng d'ADNc comme quantité de référence, une dilution en gradient peut être réalisée afin de déterminer la quantité optimale de matrice, compte tenu du nombre variable de copies des gènes cibles dans les matrices de différentes espèces. De plus, lors de l'utilisation d'ADNc (solution de réaction RT) issu d'une réaction RT-qPCR en deux étapes comme matrice, la quantité ajoutée ne doit pas dépasser 10 % du volume du système réactionnel qPCR.
3. qPCR RProgramme d'action
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Réaction UDG | 37 °C | 2 min | 1 |
| Prédénaturation | 95 °C | 3 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 5 s | 40 |
| Recuit et extension | 60℃ | 30-34 s* | |
| Courbe de fusion | Par défaut de l'instrument | / | 1 |
* Vérifiez qu'une étape de collecte de signal est effectuée après chaque étape d'extension. La durée de cette étape varie selon les machines : 30 s pour StepOne Plus, 31 s pour 7300 et 34 s pour 7500. Sauf indication contraire, la durée par défaut est de 30 s.
Données Analyse
1. Tracer la courbe d'étalonnage à partir des valeurs Ct et de la quantité d'échantillon. Le coefficient de corrélation (R²) de la courbe d'étalonnage doit être supérieur à 0,98, avec une pente comprise entre -3 et -3,5. L'efficacité d'amplification par PCR (E) se situe généralement entre 90 et 120 %.
2. L'écart type (STD) des valeurs Ct entre les puits répliqués doit être
3. La courbe de fusion du produit d'amplification ne présente aucun pic significatif de produits d'amplification non spécifiques (pics non spécifiques) ni de dimères d'amorces (à confirmer par électrophorèse sur gel d'agarose si nécessaire). De plus, la température de fusion (Tm) se situe généralement entre 80 et 95 °C.
4. Validation d'un Ct valide : Une valeur Ct d'amplification valide doit être inférieure à la valeur Ct de la courbe de contrôle sans matrice, tandis que sa courbe de fusion ne doit pas présenter de pics non spécifiques.