Système de capsulage Cap1 HYJ246
Le kit de coiffage enzymatique contient l'enzyme de coiffage de la vaccine, la capside 2'-O-méthyltransférase d'ARNm et d'autres composants de coiffage. Il permet d'ajouter des structures cap0 ou cap1 à l'extrémité 5' d'un ARNm non coiffé. Cette structure est identique à la coiffe naturelle des organismes eucaryotes et peut réduire significativement l'immunogénicité de l'ARNm exogène, améliorer sa stabilité et optimiser l'efficacité de la traduction. L'enzyme de coiffage du virus de la vaccine présente dans ce kit est issue d'Escherichia coli recombinante portant le gène MR du virus de la vaccine. Cette enzyme est composée de deux sous-unités, D1R et D12L, et possède trois activités enzymatiques : triphosphatase d'ARN, guanylyltransférase et guanine méthyltransférase. La sous-unité D1 remplit les fonctions de triphosphatase d'ARN et de guanylyltransférase, tandis que la sous-unité D12 fonctionne comme une guanine méthyltransférase, ajoutant spécifiquement une structure de coiffe 7-méthylguanylate (Cap 0) à l'extrémité 5' de l'ARN.
La 2'-O-méthyltransférase de la coiffe d'ARNm est issue d'une souche recombinante d'Escherichia coli portant le gène de la 2'-O-méthyltransférase de la coiffe d'ARNm du virus de la vaccine. Cette enzyme utilise la S-adénosylméthionine (SAM) comme donneur de méthyle pour méthyler l'ARN coiffé (Coiffe 0), formant ainsi la coiffe 1. Elle ajoute un groupe méthyle en position 2'-O du premier nucléotide précédant immédiatement la coiffe à l'extrémité 5' de l'ARN.
Le système de coiffage Cap 1 catalyse quatre réactions enzymatiques : ① l’ARN triphosphatase clive l’ARN 5’-triphosphate en diphosphate ; ② l’ARN guanylyltransférase fixe le GTP sur le 5’-diphosphate de l’ARN N1 ; ③ la guanine 7-méthyltransférase, utilisant la S-adénosylméthionine comme cofacteur, catalyse la méthylation de l’azote en position 7 de la guanine ; ④ la 2’-O-méthyltransférase de l’ARNm ajoute un groupe méthyle en position 2’-O du premier nucléotide précédant immédiatement la coiffe à l’extrémité 5’ de l’ARN Cap 0.
Ce kit permet de fixer 50 μg d'ARN en une seule réaction, ce qui permet une production à plus grande échelle, de l'ordre du milligramme. Cette fixation améliore l'efficacité de la traduction de l'ARNm, optimisant ainsi son expression lors des expériences de transfection et de micro-injection.
Composants
| Composants | Concentration | 50T |
| Enzyme de coiffage du virus de la vaccine | 10 U/μL | 250 μL |
| ARNm Cap 2'-O-Méthyltransférase | 50 U/μL | 250 μL |
| SEUL | 32 mM | 50 μL |
| GTP | 100 mM | 50 μL |
| Inhibiteur de RNase recombinant | 40 U/μL | 150 μL |
| Tampon de plaquage 10× | / | 500 μL |
Stockage
À conserver entre -25 et -15 °C. Valable 1 an.
tampon de stockage
20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 °C), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glycérol.
Définition de l'activité
1. Enzyme de coiffage du virus de la vaccine : Une unité (U) d'activité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour incorporer complètement 10 pmol de GTP dans un transcrit de 80 nt en 1 heure à 37 °C.
2. Coiffe de l'ARNm 2'-O-méthyltransférase :Une unité (U) d'activité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour méthyler 10 pmol d'un transcrit d'ARN coiffé de 80 nt en 1 heure à 37 °C.