Kit d'analyse de la taille de l'ADN résiduel CHO-HYI161

Composants et stockage

Réactif	Quantité	Stockage
Tampon de réaction qPCR	8 tubes de 850 µL	-20℃ protéger de la lumière
CHO Primer&Probe MIX-95	300 µL x 1 tube
CHO Primer&Probe MIX-110	300 µL x 1 tube
CHO Primer&Probe MIX-215	300 µL x 1 tube
CHO Primer&Probe MIX-523	300 µL x 1 tube
IPC MIX	550 µL x 1 tube
Contrôle de l'ADN CHO	50 µL x 1 tube	-20℃
Tampon de dilution d'ADN (DDB)	1,5 mL × 3 tubes

Les composants du kit peuvent être conservés dans des conditions appropriées pendant 24 mois maximum. Veuillez vérifier la date de péremption sur les étiquettes.

Instruments utilisés, y compris, mais sans s'y limiter, les suivants

• Système PCR en temps réel 7500
• Système PCR en temps réel CFX96
• Système PCR en temps réel LightCycler480

Matériel nécessaire non inclus dans le kit

• Tubes à microcentrifuger antiadhésifs, sans DNase et à faible rétention, 1,5 mL
• Embouts antiadhésifs à faible rétention, 1000 µL, 100 µL, 10 µL
• Plaques qPCR à 96 puits ou tubes PCR à 8 barrettes

Équipements connexes

• Système PCR en temps réel
• Mélangeur à vortex
• Agitateur de microplaques
• Pipettes, 1000μL, 100μL, 10μL
• agitateur de microplaques

Flux de travail

Instructions

1. Préparation de l'expérience

1.1 Portez des lunettes de protection, un masque, des vêtements et des gants appropriés.

1.2 Irradier la table, les pipettes et les tubes aux UV pendant 30 minutes et désinfecter avec de l'éthanol à 75 %.

1.3 Décongeler complètement le kit à 2-8°C ou le faire fondre sur de la glace.

2. Dilutions en série du contrôle d'ADN pour la courbe standard

Remarque : Le kit contient quatre mélanges d’amorces et de sondes CHO pour différentes longueurs de fragments. Veuillez établir quatre courbes standard distinctes, une pour chaque longueur de fragment.

Veuillez vérifier la concentration sur l'étiquette du tube contenant le CHO Contrôle de l'ADN avant dilution.

Préparer la solution de contrôle d'ADN CHO avec le tampon de dilution d'ADN (DDB) en suivant la procédure de dilution en série ci-dessous :

1) Décongeler complètement l'ADN CHO de contrôle et le DDB à une température de 2 à 8 °C ou les faire fondre sur de la glace. Vortexer pour bien mélanger et centrifuger rapidement les réactifs pendant 3 à 5 secondes dans une microcentrifugeuse. Répéter l'opération 3 fois.

2) Étiquetez six tubes à microcentrifuger antiadhésifs de 1,5 mL : ST0, ST1, ST2, ST3, ST4 et ST5.

3) Diluer le contrôle d'ADN à 3 000 pg/µL avec du DDB dans le tube ST0. Vortexer pour bien mélanger, puis centrifuger rapidement les réactifs pendant 3 à 5 secondes dans une microcentrifugeuse. Répéter l'opération 3 fois pour obtenir un mélange homogène.

4) Ajouter 180 μL de DDB à chaque tube de ST1, ST2, ST3, ST4 et ST5.

5) Effectuez les dilutions en série selon le tableau 2 :

Tableau 2. Dilution pour CHO Contrôle de l'ADN

Tube de dilution en série	Dilution	Conc. (pg/μL)
ST0	Diluer le contrôle ADN avec du DDB	3000
ST1	20 μL ST0 + 180 μL DDB	300
ST2	20 μL ST1 + 180 μL DDB	30
ST3	20 μL ST2 + 180 μL DDB	3
ST4	20 μL de ST3 + 180 μL de DDB	0,3
ST5	20 μL de ST4 + 180 μL de DDB	0,03

• Le DDB non utilisé restant doit être conservé entre 2 et 8 °C. Si la solution est trouble ou contient des précipités, la chauffer à 37 °C jusqu'à ce qu'elle devienne limpide.
• Il convient d'inclure au moins cinq concentrations pour la courbe d'étalonnage. Afin de sélectionner les dilutions d'échantillon appropriées, nous recommandons de valider la méthode avant l'analyse des échantillons.

3. Préparation des échantillons

1) Préparation des échantillons d'essai

Prélevez 100 μL de l'échantillon à tester et ajoutez-les à un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL.

2) Préparation des échantillons de contrôle de référence d'extraction (ERC)

Selon le CHO Concentration d'ADN ajouté dans les échantillons ERC (Prenons comme exemple les échantillons contenant 30 pg d'ADN CHO), la procédure de préparation spécifique est la suivante :

2.1) Prélevez 100 μL de l'échantillon à tester et transférez-les dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL.

2.2) Ajouter 10 μL de solution ST3 et mélanger soigneusement, étiqueter comme échantillon ERC.

3) Préparation de l'échantillon témoin négatif (ETN)

Ajouter 100 μL de DDB à un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL et l'étiqueter NCS.

4. Préparation du mélange qPCR

1) Déterminer le nombre de puits de réaction à partir de la courbe d'étalonnage, en fonction du nombre d'échantillons à tester et d'échantillons témoins. Généralement, chaque échantillon est testé en triplicata. Nombre de puits de réaction = (courbe d'étalonnage de 5 gradients de concentration + 1 NTC + 1 NCS + échantillons à tester) × 3

2) Préparer le mélange qPCR séparément selon le tableau 3 - 6.

Tableau 3. Préparation du mélange qPCR MIX-95

Réactifs	Volume/réaction	Volume pour 30 réactions(incluant un dépassement de 10 %)
Tampon de réaction qPCR	15,9 μL	524,7 μL
CHO Primer&Probe MIX-95	2,8 μL	92,4 μL
IPC MIX	1,3 μL	42,9 μL
Volume total	20 μL	660 μL

Tableau 4. Préparation du mélange qPCR MIX-110

Réactifs	Volume/réaction	Volume pour 30 réactions(incluant un dépassement de 10 %)
Tampon de réaction qPCR	15,9 μL	524,7 μL
CHO Primer&Probe MIX-110	2,8 μL	92,4 μL
IPC MIX	1,3 μL	42,9 μL
Volume total	20 μL	660 μL

Tableau 5. Préparation du mélange qPCR-215

Réactifs	Volume/réaction	Volume pour 30 réactions(incluant un dépassement de 10 %)
Tampon de réaction qPCR	15,9 μL	524,7 μL
CHO Primer&Probe MIX-215	2,8 μL	92,4 μL
IPC MIX	1,3 μL	42,9 μL
Volume total	20 μL	660 μL

Tableau 6. Préparation du mélange qPCR MIX-523

Réactifs	Volume/réaction	Volume pour 30 réactions(incluant un dépassement de 10 %)
Tampon de réaction qPCR	15,9 μL	524,7 μL
CHO Primer&Probe MIX-523	2,8 μL	92,4 μL
IPC MIX	1,3 μL	42,9 μL
Volume total	20 μL	660 μL

3) Après avoir bien mélangé le mélange qPCR, 20 μL de chaque tube sont répartis dans des tubes PCR à 8 puits ou une plaque qPCR à 96 puits.

5. Préparation du mélange réactionnel pour qPCR

1) Préparer le mélange réactionnel qPCR selon le tableau 7-10 et la disposition de la plaque 96 puits comme indiqué dans le tableau 11.

Tableau 7. Préparation du mélange réactionnel qPCR MIX-95

Tubes	Courbe standard - 95	NTC	NCS	Échantillon d'essai
Mélange qPCR	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Échantillons	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purifié	10 μL d'échantillon de test purifié
Volume total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tableau 8. Préparation du mélange réactionnel qPCR MIX-110

Tubes	Courbe standard - 110	NTC	NCS	Échantillon d'essai
Mélange qPCR	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Échantillons	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purifié	10 μL d'échantillon de test purifié
Volume total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tableau 9. Préparation du mélange réactionnel qPCR MIX-215

Tubes	Courbe standard - 215	NTC	NCS	Échantillon d'essai
Mélange qPCR	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Échantillons	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purifié	10 μL d'échantillon de test purifié
Volume total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tableau 10. Préparation du mélange réactionnel qPCR MIX-523

Tubes	Courbe standard - 523	NTC	NCS	Échantillon d'essai
Mélange qPCR	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Échantillons	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purifié	10 μL d'échantillon de test purifié
Volume total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tableau 11. Exemple d'agencement d'une plaque à 96 puits

Planche 1 :

MIX-95

MIX-110

UN

ST1

ST1

ST1

S1

S2

NTC

ST1

ST1

ST1

S1

S2

NTC

B

ST2

ST2

ST2

S1

S2

NTC

ST2

ST2

ST2

S1

S2

NTC

C

ST3

ST3

ST3

S1

S2

NTC

ST3

ST3

ST3

S1

S2

NTC

D

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ET

ST5

ST5

ST5

S1 ERC

S2 ERC

NCS

ST5

ST5

ST5

S1 ERC

S2 ERC

NCS

F

S1 ERC

S2 ERC

NCS

S1 ERC

S2 ERC

NCS

G

S1 ERC

S2 ERC

NCS

S1 ERC

S2 ERC

NCS

H

Planche 2 :

MIX-215

MIX-523

UN

ST1

ST1

ST1

S1

S2

NTC

ST1

ST1

ST1

S1

S2

NTC

B

ST2

ST2

ST2

S1

S2

NTC

ST2

ST2

ST2

S1

S2

NTC

C

ST3

ST3

ST3

S1

S2

NTC

ST3

ST3

ST3

S1

S2

NTC

D

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ET

ST5

ST5

ST5

S1 ERC

S2 ERC

NCS

ST5

ST5

ST5

S1 ERC

S2 ERC

NCS

F

S1 ERC

S2 ERC

NCS

S1 ERC

S2 ERC

NCS

G

S1 ERC

S2 ERC

NCS

S1 ERC

S2 ERC

NCS

H

• Cet exemple représente quatre essais, comprenant des points de courbe standard sélectionnés du contrôle d'ADN CHO (ST1～ST5), 1 NTC, 1 NCS, 2 échantillons de test (S1-S2) et 2 échantillons ERC (S1 ERC à S2 ERC), avec 3 réplicats pour chaque échantillon.
• La disposition des plaques pour le chargement des échantillons peut être ajustée en fonction de la quantité d'échantillons.

2) Sceller la plaque 96 puits avec un film de scellage. Bien mélanger dans un agitateur de microplaques, puis centrifuger les réactifs pendant 10 secondes dans une microcentrifugeuse et placer la plaque sur l'appareil qPCR.

6. Paramètres du programme qPCR

REMARQUE : Les instructions suivantes s’appliquent uniquement à l’instrument ABI7500 avec SDS v1.4. Si vous utilisez un instrument ou un logiciel différent, reportez-vous à la documentation correspondante.

1) Créez un nouveau document, puis dans la liste déroulante Analyse, sélectionnez Courbe standard (Quantification absolue).

2) Cliquez Nouveau détecteur, puis saisissez CHO-95 dans le champ Nom, sélectionnez FAM dans la liste déroulante Reporter Dye et sélectionnez (aucun) dans la liste déroulante Teinture Quencher, puis cliquez D'ACCORD.

3) Créez un nouveau détecteur pour CHO-110, CHO-215 et CHO-523, séparément comme à l'étape 2.

4) Cliquez Nouveau détecteur, puis saisissez IPC dans le champ Nom. Sélectionnez VIC dans la liste déroulante Reporter Dye et sélectionnez (aucun) dans la liste déroulante Teinture Quencher, puis cliquez D'ACCORD.

5) Sélectionner ROX comme colorant de référence passif, puis cliquez Suivant.

6) Sélectionnez l'ensemble de puits approprié pour les échantillons, puis sélectionnez le détecteur correspondant pour chaque puits.

7) Sélectionnez Terminer, puis définissez les conditions de cyclage thermique :

7.1) Réglez le volume de réaction du cycle thermique à 30 μL.

7.2) Réglez la température et la durée comme indiqué dans le tableau 12 :

Tableau 12. Température et durée de la qPCR

Étape	Temp.	Temps (mm:sec)	Cycles
Activation	95℃	10h00	1
Dénaturation	95℃	00:15	40
recuit	60℃	00:30
Extension	72℃*	01:30

*L'instrument lira le signal de fluorescence au cours de cette étape.

8) Enregistrez le document, puis cliquez Commencer pour démarrer l'analyse qPCR en temps réel.

7. Analyse des résultats

1) Sélectionner Installation Dans l'onglet, définissez ensuite les tâches pour chaque type d'échantillon en cliquant sur la liste déroulante de la colonne Tâche :

1.1) NTC : tâche de détection d’ADN cible = NTC

1.2) NCS, échantillons de test = Inconnu

2) Établissez la courbe standard comme indiqué dans le tableau suivant :

Tableau 13. Paramètres de la courbe standard

Étiquette du tube	Tâche	Quantité (pg/μL)
ST1	Standard	300
ST2	Standard	30
ST3	Standard	3
ST4	Standard	0,3
ST5	Standard	0,03

3) Sélectionnez le Onglet Résultats, puis sélectionnez Graphique d'amplification.

4) Dans la liste déroulante Données, sélectionnez Delta Rn vs Cycle.

5) Dans la fenêtre Paramètres d'analyse, saisissez les paramètres suivants :

5.1) Sélectionner Manuel Ct.

5.2) Dans le champ Seuil, entrez 0,02.

5.3) Sélectionner Ligne de base automatique.

6) Cliquez sur le bouton dans la barre d'outils, puis attendez l'analyse de la plaque.

7) Sélectionnez le Résultat onglet >>courbe standard Dans l'onglet correspondant, vérifiez la pente, l'ordonnée à l'origine et le coefficient de détermination (R²).² valeurs.

8) Sélectionnez l'onglet Rapport, puis calculez la quantité moyenne et l'écart type pour chaque échantillon.

9) Sélectionner Déposer > > Exporter > > RésultatsDans la liste déroulante Type de fichier, sélectionnez Fichiers d'exportation des résultats, puis cliquez Sauvegarder.

10) Définissez la valeur de la taille de l'ADN-95 à 100%, calculez le pourcentage de la taille de l'ADN de 110, 215 et 523.

Remarque : Les paramètres d'analyse des résultats doivent être adaptés au modèle et à la version du logiciel, et peuvent généralement être interprétés automatiquement par l'instrument.