Désoxyribonucléase I (DNase I), provenant du pancréas bovin HYC118
La DNase I est une endonucléase capable de digérer l'ADN simple brin et double brin pour produire des désoxynucléotides simples ou des oligodésoxynucléotides simple brin ou double brin. Elle hydrolyse la liaison phosphodiester pour produire des monodésoxynucléotides et des oligodésoxynucléotides contenant des groupes phosphate en 5' et hydroxyle en 3'. Le produit de digestion moyen est le plus petit polytétranucléotide. La DNase I peut catalyser de nombreuses formes d'ADN, telles que l'ADN simple brin, l'ADN double brin et même la chromatine (son taux de clivage est influencé par les histones). Son pH optimal se situe entre 7 et 8. L'activité de la DNase I dépend du Ca²⁺.+ et peut être activé par des ions métalliques divalents, tels que le Co2+, Mn²+, Zn²+, etc. 5 mM Ca²+ peut protéger l'enzyme de l'hydrolyse. En présence de Mg²⁺+, l'enzyme peut reconnaître et couper n'importe quel site sur n'importe quel brin d'ADN de manière aléatoire ; et en présence de Mn²+Cette enzyme peut reconnaître simultanément deux brins d'ADN et les couper quasiment au même endroit, formant ainsi des extrémités franches ou des extrémités cohésives avec 1 à 2 nucléotides en saillie. La DNase I a été isolée pour la première fois du pancréas, et le pancréas des mammifères demeure une source majeure de cette enzyme. Ce produit est dérivé du pancréas bovin et se compose de quatre composants chromatographiquement distincts (A, B, C et D) dans un rapport molaire de 4:1:1, le composant D étant présent en très faible quantité. Il est fréquemment utilisé en biologie moléculaire pour dissocier l'ADN des protéines ou pour créer des brèches dans l'ADN afin d'y insérer des bases marquées. Ce produit est fourni sous forme de poudre lyophilisée contenant du chlorure de calcium et présente une activité enzymatique ≥ 2 000 unités Kunitz/mg de protéine.
Composants
| Composants | Taille-1 | Taille 2 |
| Désoxyribonucléase I (DNase I), provenant du pancréas bovin | 15 À | 10 × 15 KU |
Stockage
À conserver à -15°C ~ -25°C pendant 2 ans.
Définition de l'unité
Dans des conditions de 25°C et de pH 5,0, la DNase catalyse l'ADN, et la variation de ΔA260 par ml par minute d'augmentation de 0,001 est définie comme une unité d'activité enzymatique (unité Kunitz).
Spécification
| N° CAS | 9003-98-9 |
| Poids moléculaire | ~31 kDa |
| Unités Kunitz | ≥ 2000 unités Kunitz/mg de protéines |
| Taper | Type IV |
| pH optimal | 7～8 |
| Apparence | Poudre lyophilisée blanche à brun clair |
| Pureté | Protéines : ≥ 80 % par la méthode du biuret |
| Solubilité | Solution de NaCl 0,15 M : 5 mg/mL, incolore et transparente |
| Activateurs | Divers ions métalliques divalents tels que Mg2+、Mn2+, Comme2+, Co2+et Zn2+ |
| Inhibiteurs | β-mercaptoéthanol ; agent chélateur ; SDS ; actine |
| Solution de stockage | 20 mM d'acétate de sodium (pH 6,5), 5 mM de CaCl2, 0,1 mM de PMSF, 50 % de glycérol. |
Inactivation ou inhibition de la DNase I
L'ajout d'EDTA à une concentration finale de 2,5 mM, suivi d'un chauffage à 65 °C pendant 10 minutes, inactive la DNase I. L'extraction au phénol-chloroforme inactive également la DNase I. Les chélateurs d'ions métalliques, les ions zinc à des concentrations millimolaires/litre, le SDS à 0,1 %, les agents réducteurs tels que le DTT et le mercaptoéthanol, ainsi que les concentrations salines supérieures à 50-100 mM, exercent tous des effets inhibiteurs significatifs sur la DNase I.
Instructions
Appliqué aux expériences d'extraction de protéines, à titre indicatif seulement
1. Système réactionnel : Ajouter 1/100e du volume de solution de conservation de DNase I à l'extrait protéique (pour obtenir une concentration finale de 20 U/mL) et ajouter 1 M de MgCl₂.2 à 1/100 du volume.
2. Conditions de réaction : 37 °C, 30 à 60 min. Poursuivre avec les expériences d’extraction de protéines suivantes.
Remarque : L'EDTA pouvant chélater le calcium2+et Mg2+L'EDTA, nécessaire à l'activité enzymatique, doit être éliminé de la solution initiale de lyse des protéines, sinon il réduira la capacité digestive de la DNase I.