Poly(A) polymérase d'E. coli – HYJ233
La poly(A) polymérase catalyse l'ajout d'AMP, converti à partir d'ATP, à l'extrémité 3' de l'ARN d'une manière indépendante de la matrice.
Composants
| Composants | 100 U | 500 U |
| Poly(A) polymérase d'E. coli (5 000 U/mL) | 20 μL | 100 μL |
| Tampon de réaction de poly(A) polymérase 10X | 1,5 mL | 1,5 mL |
| ATP (10 mM) | 200 μL | 200 μL |
Stockage
À conserver à -20°C.
Tampon de stockage
Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, glycérol 50 %, Triton 0,1 % (p/v)® X-100, pH 7,5 à 25 °C
Source
Dérivé d'une souche d'Escherichia coli portant le gène de la poly(A) polymérase cloné à partir d'E. coli.
Définition de l'activité
Une unité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour catalyser l'incorporation de 1 nmol d'AMP dans l'ARN en 10 minutes à 37 °C dans un mélange réactionnel de 20 µl.
Applications
- Marquage de l'ARN avec de l'ATP ou de la cordycépine.
- Ajout de queues Poly(A) à l'ARN pour le clonage ou la purification par affinité.
- Augmenter la stabilité de l'ARNm pour améliorer l'efficacité de la traduction dans les cellules eucaryotes après transfection.
Inhibition et inactivation
Inactiver à 80°C pendant 15 min.
Instruction
1. Ajouter les composants de la réaction suivants sur glace selon le tableau ci-dessous (exemple pour un volume réactionnel de 20 μL) :
| Composants | Volume |
| Tampon de réaction de poly(A) polymérase 10X | 2 μL |
| ATP (10 mM) | 2 μL |
| Poly(A) polymérase d'E. coli | 1 μL |
| ARN (1-10 μg) | 10 μL |
| ddH2LE | Jusqu'à 20 μL |
2. Mélangez soigneusement tous les composants de la réaction et centrifugez brièvement pour recueillir la solution au fond du tube.
3. Incuber à 37°C pendant 30 minutes.
4. Inactiver par la chaleur en incubant à 85 °C pendant 15 minutes ou ajouter de l'EDTA à une concentration finale de 10 mM.
5. Un inhibiteur de RNase peut être ajouté pour améliorer la stabilité de l'ARN dans la solution, à une concentration 1X de 1 U/μL.