Kit d'analyse de la taille de l'ADN résiduel d'E. coli - HYI162

Composants et stockage

Réactif	Quantité	Stockage
Tampon de réaction qPCR	8 tubes de 850 µL	-20℃ protéger de la lumière
Mélange d'amorces et de sondes E. coli-85	300 µL x 1 tube
Mélange d'amorces et de sondes E. coli MIX-103	300 µL x 1 tube
Mélange d'amorces et de sondes E. coli MIX-220	300 µL x 1 tube
Mélange d'amorces et de sondes E. coli-550	300 µL x 1 tube
IPC MIX	550 µL x 1 tube
Contrôle de l'ADN d'E. coli	50 µL x 1 tube	-20℃
Tampon de dilution d'ADN (DDB)	1,5 mL × 3 tubes

Les composants du kit peuvent être conservés dans des conditions appropriées pendant 24 mois maximum. Veuillez vérifier la date de péremption sur les étiquettes.

Instruments utilisés, y compris, mais sans s'y limiter, les suivants

• Système PCR en temps réel 7500
• Système PCR en temps réel CFX96
• Système PCR en temps réel LightCycler480

Matériel nécessaire non inclus dans le kit

• Tubes à microcentrifuger antiadhésifs, sans DNase et à faible rétention, 1,5 mL
• Embouts antiadhésifs à faible rétention, 1000 µL, 100 µL, 10 µL
• Plaques qPCR à 96 puits ou tubes PCR à 8 barrettes

Équipements connexes

• Système PCR en temps réel
• Mélangeur à vortex
• Agitateur de microplaques
• Pipettes, 1000μL, 100μL, 10μL
• agitateur de microplaques

Flux de travail

Instructions

1. Préparation de l'expérience

1.1 Portez des lunettes de protection, un masque, des vêtements et des gants appropriés.

1.2 Irradier la table, les pipettes et les tubes aux UV pendant 30 minutes et désinfecter avec de l'éthanol à 75 %.

1.3 Décongeler complètement le kit à 2-8°C ou le faire fondre sur de la glace.

2. Dilutions en série du contrôle d'ADN pour la courbe standard

Remarque : Le kit contient quatre mélanges d’amorces et de sondes E. coli pour différentes longueurs de fragments. Veuillez établir quatre courbes standard distinctes, une pour chaque longueur de fragment.

Veuillez vérifier la concentration sur l'étiquette du tube contenant le contrôle d'ADN d'E. coli avant dilution.

Préparer quatre séries de solutions témoins d'ADN d'E. coli avec tampon de dilution d'ADN (DDB) en suivant la procédure de dilution en série ci-dessous :

2.1 Décongeler complètement l'ADN de contrôle d'E. coli et le DDB à une température de 2 à 8 °C ou les faire fondre sur de la glace. Vortexer pour bien mélanger et centrifuger rapidement les réactifs pendant 3 à 5 secondes dans une microcentrifugeuse. Répéter l'opération 3 fois.

2.2 Étiquetez six tubes à microcentrifuger antiadhésifs de 1,5 mL : ST0, ST1, ST2, ST3, ST4 et ST5.

2.3 Diluer le contrôle d'ADN à 3000 pg/µL avec du DDB dans le tube ST0. Vortexer pour bien mélanger et centrifuger rapidement les réactifs pendant 3 à 5 secondes dans une microcentrifugeuse. Répéter l'opération 3 fois pour obtenir un mélange homogène.

2.4 Ajouter 180 μL de DDB à chaque tube de ST1, ST2, ST3, ST4 et ST5.

2.5 Effectuer les dilutions en série selon le tableau 2 :

Tableau 2. Dilution pour E. coli Contrôle de l'ADN

Tube de dilution en série	Dilution	Conc. (pg/μL)
ST0	Diluer le contrôle ADN avec du DDB	3000
ST1	20 μL ST0 + 180 μL DDB	300
ST2	20 μL ST1 + 180 μL DDB	30
ST3	20 μL ST2 + 180 μL DDB	3
ST4	20 μL de ST3 + 180 μL de DDB	0,3
ST5	20 μL de ST4 + 180 μL de DDB	0,03

• Le DDB non utilisé restant doit être conservé entre 2 et 8 °C. Si la solution est trouble ou contient des précipités, la chauffer à 37 °C jusqu'à ce qu'elle devienne limpide.
• Il convient d'inclure au moins cinq concentrations pour la courbe d'étalonnage. Afin de sélectionner les dilutions d'échantillon appropriées, nous recommandons de valider la méthode avant l'analyse des échantillons.

3. Préparation des échantillons

Ajouter 100 μL de DDB dans un nouveau tube à microcentrifuger de 1,5 mL et l’étiqueter NCS. Les échantillons NCS et les autres échantillons doivent être préparés de la même manière pour l’extraction d’ADN.

4. Préparation du mélange qPCR

4.1 Déterminer le nombre de puits de réaction à partir de la courbe d'étalonnage, en fonction du nombre d'échantillons à tester et d'échantillons témoins. Généralement, chaque échantillon est testé en triplicata. Nombre de puits de réaction = (courbe d'étalonnage de 5 gradients de concentration + 1 NTC + 1 NCS + échantillons à tester) × 3

4.2 Préparer le mélange qPCR séparément selon le tableau 3 - 6.

Tableau 3. Préparation du mélange qPCR MIX-85

Réactifs	Volume/réaction	Volume pour 30 réactions(incluant un dépassement de 10 %)
Tampon de réaction qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mélange d'amorces et de sondes E. coli-85	2,8 μL	92,4 μL
IPC MIX	1,3 μL	42,9 μL
Volume total	20 μL	660 μL

Tableau 4. Préparation du mélange qPCR MIX-103

Réactifs	Volume/réaction	Volume pour 30 réactions (incluant un dépassement de 10 %)
Tampon de réaction qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mélange d'amorces et de sondes E. coli MIX-103	2,8 μL	92,4 μL
IPC MIX	1,3 μL	42,9 μL
Volume total	20 μL	660 μL

Tableau 5. Préparation du mélange qPCR MIX-220

Réactifs	Volume/réaction	Volume pour 30 réactions (incluant un dépassement de 10 %)
Tampon de réaction qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mélange d'amorces et de sondes E. coli MIX-220	2,8 μL	92,4 μL
IPC MIX	1,3 μL	42,9 μL
Volume total	20 μL	660 μL

Tableau 6. Préparation du mélange qPCR MIX-550

Réactifs	Volume/réaction	Volume pour 30 réactions (incluant un dépassement de 10 %)
Tampon de réaction qPCR	15,9 μL	524,7 μL
Mélange d'amorces et de sondes E. coli-550	2,8 μL	92,4 μL
IPC MIX	1,3 μL	42,9 μL
Volume total	20 μL	660 μL

Pour la détection simultanée des quatre fragments, veuillez préparer au moins 120 μL d'ADN matrice pour les quatre analyses. Nous recommandons de préparer deux tubes de chaque échantillon pour le prétraitement et de les regrouper après extraction.

4.3 Après avoir bien mélangé le mélange qPCR, 20 μL de chaque tube sont répartis dans des tubes PCR à 8 bandes ou une plaque qPCR à 96 puits.

5. Préparation du mélange réactionnel pour qPCR

5.1 Préparer le mélange réactionnel qPCR selon le tableau 7-10 et la disposition de la plaque 96 puits comme indiqué dans le tableau 11.

Tableau 7. Préparation du mélange réactionnel qPCR MIX-85

Tubes	Courbe standard - 85	NTC	NCS	Échantillon d'essai
qPCR MIX-85	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Échantillons	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purifié	10 μL d'échantillon de test purifié
Volume total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tableau 8. Préparation du mélange réactionnel qPCR MIX-103

Tubes	Courbe standard-103	NTC	NCS	Échantillon d'essai
qPCR MIX-103	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Échantillons	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purifié	10 μL d'échantillon de test purifié
Volume total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tableau 9. Préparation du mélange réactionnel qPCR MIX-220

Tubes	Courbe standard - 220	NTC	NCS	Échantillon d'essai
qPCR MIX-220	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Échantillons	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purifié	10 μL d'échantillon de test purifié
Volume total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tableau 10. Préparation du mélange réactionnel qPCR MIX-550

Tubes	Courbe standard - 550	NTC	NCS	Échantillon d'essai
qPCR MIX-550	20 μL	20 μL	20 μL	20 μL
Échantillons	10 μL ST1 - ST5	10 μL de DDB	10 μL de NCS purifié	10 μL d'échantillon de test purifié
Volume total	30 μL	30 μL	30 μL	30 μL

Tableau 11. Exemple d'agencement d'une plaque à 96 puits

MIX-95

MIX-103

MIX-220

MIX-550

UN

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

B

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

C

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

D

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ST5

ET

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

ST4

F

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

ST3

G

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

ST2

H

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

ST1

• Cet exemple représente quatre analyses, comprenant des points de courbe standard sélectionnés de contrôle d'ADN E.coli (ST1-ST5), 1 NTC, 1 NCS et 1 échantillon de test, avec 3 réplicats pour chaque échantillon.
• La disposition des plaques pour le chargement des échantillons peut être ajustée en fonction de la quantité d'échantillons.

5.2 Sceller la plaque 96 puits avec un film de scellage. Bien mélanger dans un agitateur de microplaques, puis centrifuger les réactifs pendant 10 secondes dans une microcentrifugeuse et placer la plaque sur l'instrument qPCR.

6. Paramètres du programme qPCR

REMARQUE : Les instructions suivantes s’appliquent uniquement à l’instrument ABI7500 avec SDS v1.4. Si vous utilisez un instrument ou un logiciel différent, reportez-vous à la documentation correspondante.

6.1 Créez un nouveau document, puis dans la liste déroulante Analyse, sélectionnez Courbe standard (Quantification absolue).

6.2 Cliquez Nouveau détecteur, puis saisissez E.coli-85 dans le champ Nom, sélectionnez FAM dans la liste déroulante Reporter Dye et sélectionnez (aucun) dans la liste déroulante Teinture Quencher, puis cliquez D'ACCORD.

6.3 Créez un nouveau détecteur pour E.coli-103, E.coli-220 et E.coli-550, séparément comme à l'étape 2.

6.4 Cliquez Nouveau détecteur, puis saisissez IPC dans le champ Nom. Sélectionnez VIC dans la liste déroulante Reporter Dye et sélectionnez (aucun) dans la liste déroulante Teinture Quencher, puis cliquez D'ACCORD.

6.5 Sélectionner ROX comme colorant de référence passif, puis cliquez Suivant.

6.6 Sélectionnez l’ensemble de puits approprié pour les échantillons, puis sélectionnez le détecteur correspondant pour chaque puits.

6.7 Sélectionnez Terminer, puis définissez les conditions de cyclage thermique :

6.7.1 Régler le volume de réaction de cyclage thermique à 30 μL.

6.7.2 Réglez la température et la durée comme indiqué dans le tableau 12 :

Tableau 12. Température et durée de la qPCR

Étape	Temp.	Temps (mm:sec)	Cycles
Activation	95℃	10h00	1
Dénaturation	95℃	00:15	40
recuit	60℃	00:30
Extension	72℃*	01:30

*L'instrument lira le signal de fluorescence au cours de cette étape.

6.8 Enregistrez le document, puis cliquez Commencer pour démarrer l'analyse qPCR en temps réel.

7. Analyse des résultats

7.1 Sélectionner Installation Dans l'onglet, définissez ensuite les tâches pour chaque type d'échantillon en cliquant sur la liste déroulante de la colonne Tâche :

7.1.1 NTC : tâche de détection d’ADN cible = NTC

7.1.2 NCS, échantillons de test = Inconnu

7.2 Établir la courbe standard comme indiqué dans le tableau suivant :

Tableau 13. Paramètres de la courbe standard

Étiquette du tube	Tâche	Quantité (pg/μL)
ST1	Standard	300
ST2	Standard	30
ST3	Standard	3
ST4	Standard	0,3
ST5	Standard	0,03

7.3 Sélectionnez le Résultats onglet, puis sélectionnez Graphique d'amplification.

7.4 Dans la liste déroulante Données, sélectionnez Delta Rn vs Cycle.

7.5 Dans la fenêtre Paramètres d'analyse, saisissez les paramètres suivants :

7.5.1 Sélectionner Manuel Ct.

7.5.2 Dans le champ Seuil, entrez 0,02.

7.5.3 Sélectionner Ligne de base automatique.

7.6 Cliquez sur le bouton dans la barre d'outils, puis attendez l'analyse de la plaque.

7.7 Sélectionnez le Résultat onglet >>courbe standard Dans l'onglet correspondant, vérifiez la pente, l'ordonnée à l'origine et le coefficient de détermination (R²).² valeurs.

7.8 Sélectionnez l'onglet Rapport, puis calculez la quantité moyenne et l'écart type pour chaque échantillon.

7.9 Sélectionner Déposer > > Exporter > > RésultatsDans la liste déroulante Type de fichier, sélectionnez Fichiers d'exportation des résultats, puis cliquez Sauvegarder.

Remarque : Les paramètres d'analyse des résultats doivent être adaptés au modèle et à la version du logiciel, et peuvent généralement être interprétés automatiquement par l'instrument.

7.10 Définissez la valeur de la taille de l'ADN-85 à 100%, calculez le pourcentage de la taille de l'ADN de 103, 220 et 550.

7.11 Analyser la valeur Ct de l'IPC. Normalement, la valeur Ct-IPC moyenne de l'échantillon doit se situer à ±1,0 de la valeur Ct-IPC du NCS. Si la valeur Ct-IPC moyenne de l'échantillon est significativement supérieure à celle du NCS, cela indique que l'échantillon peut inhiber le dosage. Nous recommandons de tester les échantillons ERC dans le même dosage et de prendre le taux de récupération de l'échantillon comme critère.

7.12 La valeur Ct de NTC et NCS doit être supérieure à la valeur Ct moyenne de la concentration de la courbe standard la plus basse ou aucun pic significatif n'est affiché dans la courbe d'amplification, tout en effectuant une courbe d'amplification normale dans le canal de signal VIC.