Prémélange FastAmpli Probe RT-qPCR plus-UNG HYA432
détails du produit
Le prémix FastAmpli Probe RT-qPCR plus-UNG est un réactif spécialisé pour la détection quantitative par fluorescence (sonde TaqMan) de l'amplification d'ARN. Il contient une transcriptase inverse et une ADN polymérase à amplification rapide, génétiquement modifiées et sélectionnées, permettant de réaliser les réactions PCR en 20 à 40 minutes. Ce produit présente une forte tolérance aux inhibiteurs, une transcription inverse et une efficacité d'amplification PCR accrues, ce qui le rend idéal pour l'amplification haute sensibilité de matrices d'ARN à faible concentration. Il génère d'excellentes courbes standard sur une large gamme de quantification, garantissant une quantification précise. Formulé avec un mélange d'enzyme d'amplification résistante aux inhibiteurs et d'enzyme UNG, ainsi qu'un système tampon optimisé contenant du dUTP, ce réactif permet non seulement une amplification efficace des gènes cibles dans des échantillons contenant des inhibiteurs, mais prévient également efficacement les faux positifs dus à la contamination par des résidus de produits PCR et par des aérosols. Il est compatible avec les instruments de PCR en temps réel de la plupart des fabricants, notamment Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad et Roche.
Composants
1. Mélange 10×FastAmpli RTase/UNG
2. Tampon prémélangé 5×FastAmpli RT (dUTP) (Mg2+gratuit)
3. 25×MgCl2
Stockage
À conserver à -20 °C pour une conservation à long terme ; stable pendant 3 mois à 4 °C. Bien mélanger avant utilisation et éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
Instructions
1. Système réactionnel
| Composants | 25 µL Volume | 50 µL Volume | Concentration finale |
| Tampon prémélangé 5×FastAmpli RT (dUTP) (Mg2+gratuit) | 5 µL | 10 µL | 1× |
| 10×FastAmpli RTase/UNG Mix | 2,5 µL | 5 µL | 1× |
| 25×MgCl2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mélange amorce-sonde 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN matrice** | - | - | - |
| DEPC H2LE | Jusqu'à 25 µL | Jusqu'à 50 µL | - |
*Lors de l'utilisation de protocoles PCR conventionnels, une concentration finale d'amorces de 0,2 μM donne généralement des résultats satisfaisants. Si les performances de la réaction sont insatisfaisantes, la concentration d'amorces peut être ajustée entre 0,2 et 1 μM. La concentration de sonde est généralement optimale entre 0,1 et 0,3 μM. Des expériences de gradient de concentration peuvent être réalisées afin d'identifier la combinaison optimale d'amorces et de sondes. Lors de l'utilisation de protocoles PCR rapides, une augmentation appropriée des concentrations d'amorces et de sondes peut améliorer les résultats d'amplification, et le rapport amorces/sondes doit être optimisé.
**Le nombre de copies du gène cible varie selon le type de matrice. Au besoin, des dilutions en série peuvent être effectuées pour déterminer la quantité optimale de matrice à ajouter.
2. Programme de réaction
| PCR régulière programme | |||
| Sétape | Ttempérature | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50℃ | 10-20 min | 1 |
| dénaturation initiale | 95℃ | 1 à 5 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10-20 s | 40-50 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 20-60 s | |
| RputainPCR programme | |||
| Sétape | Ttempérature | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50℃ | 5 min | 1 |
| dénaturation initiale | 95℃ | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 1-3 s | 40-50 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 3-20 s | |
Contrôle de qualité
1. Tests fonctionnels : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qRT-PCR.
2. Exempt d'activité nucléasique exogène, ainsi que de contamination par des endonucléases et des exonucléases exogènes.
Informations techniquesrmation
1. Le taux d'amplification de l'ADN polymérase rapide contenue dans ce produit est d'au moins 1 kb/10 s. Des variations importantes existent au niveau de la vitesse de montée en température, du mode de contrôle de la température et de l'efficacité du transfert de chaleur entre les différents appareils de PCR rapide. Il est recommandé d'optimiser les paramètres de réaction en fonction de l'appareil de PCR rapide utilisé.
2. La durée de la transcription inverse doit être optimisée en fonction de la longueur des fragments cibles ; une durée de transcription inverse prolongée est recommandée pour les fragments plus longs.
3. La température d'hybridation-extension doit être optimisée en fonction des valeurs Tm des amorces et des sondes, ainsi que des conditions de réaction réelles.
4. Pour les amorces avec des températures d'hybridation basses ou l'amplification de longs fragments dépassant 200 pb, le protocole PCR en trois étapes est recommandé.
5. L'efficacité d'utilisation du dUTP et la sensibilité à l'enzyme UNG varient selon les gènes cibles. Par conséquent, si l'utilisation du système UNG entraîne une diminution de la sensibilité de détection, le système réactionnel doit être ajusté et optimisé en conséquence. Pour toute assistance technique, veuillez contacter notre société.
6. Utilisez des zones et des pipettes dédiées aux étapes de pré- et post-amplification. Manipulez les produits de PCR avec des gants et changez-les fréquemment. N’ouvrez pas les tubes de réaction après la PCR afin de minimiser la contamination des échantillons par les produits d’amplification.
7. À usage de recherche uniquement !