Prémélange qPCR FastDirect Probe plus-UNG HYA424
Le prémix qPCR FastDirect Probe plus-UNG est un réactif spécialisé conçu pour la détection quantitative par fluorescence directe (basée sur une sonde) de l'amplification de l'ADN de gènes cibles, éliminant ainsi le besoin d'extraction et de purification des acides nucléiques à partir des échantillons. Il contient une ADN polymérase à amplification rapide, génétiquement modifiée et sélectionnée, permettant de réaliser les réactions PCR en moins de 30 minutes. Ce produit présente une forte tolérance aux inhibiteurs, permettant la détection directe de l'amplification de l'ADN à partir d'échantillons tels que le sang total anticoagulé, le plasma, le sérum et les écouvillons de gorge, sans extraction ni purification préalables de l'ADN. De plus, formulé avec un tampon optimisé spécifique à la qPCR et un système anti-contamination UNG/dUTP, ce réactif prévient efficacement les faux positifs dus à la contamination par des résidus de produits PCR et par aérosols.
Composants
2×FastDirect Probe qPCR Premix plus-UNG
Ce réactif contient l'enzyme de démarrage à chaud, l'UNG, le tampon PCR et le MgCl₂.2, dNTP, stabilisant et autres ingrédients.
Stockage
À conserver à -20 °C pour une conservation à long terme ; stable pendant 3 mois à 4 °C. Bien mélanger avant utilisation et éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
Instruction
1. Système réactionnel
| Composants | Système 25 µL | Système 50 µL |
| 2×FastDirect Probe qPCR Premix plus-UNG | 12,5 µL | 25 µL |
| Mélange amorce-sonde 25×* | 1 µL | 2 μL |
| ADN matrice** | -- | -- |
| ddH2LE | Jusqu'à 25 µL | Jusqu'à 50 µL |
Lors de l'utilisation de protocoles PCR conventionnels, une concentration finale d'amorces de 0,2 μM donne généralement des résultats satisfaisants. Si la réaction ne donne pas de résultats satisfaisants, la concentration d'amorces peut être ajustée entre 0,2 et 1 μM. La concentration de sonde, quant à elle, est généralement optimale entre 0,1 et 0,3 μM. Des expériences de gradient de concentration permettent d'identifier la combinaison optimale d'amorces et de sondes. Lors de l'utilisation de protocoles PCR rapides, une augmentation appropriée des concentrations d'amorces et de sondes peut améliorer l'amplification, et le rapport amorces/sondes doit être optimisé.
Les types et les concentrations d'inhibiteurs, ainsi que le nombre de copies des gènes cibles, varient selon les types d'échantillons biologiques. L'impact des différentes solutions de conservation (par exemple, les solutions de conservation pour écouvillons) sur les résultats d'amplification est également variable. Par conséquent, le volume optimal d'échantillon dans le système de réaction doit être déterminé en fonction des conditions réelles, telles que le type d'échantillon et les exigences de sensibilité de détection. Si nécessaire, l'échantillon peut être dilué avec de l'eau sans nucléase ou du tampon TE avant d'être ajouté au système de réaction. Les volumes d'échantillon recommandés sont les suivants :
| Échantillon | Système 50 µL | Rapport de charge maximal |
| Sang entier | 2,5 µL | 5% |
| Plasma | 10 µL | 30% |
| Sérum | 5 µL | 10% |
| écouvillon de gorge | 2,5 µL | 5% |
2. Rprogramme d'action
| Programme PCR général | |||
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Digestion | 50 °C | 2 min | 1 |
| Démarrage à chaud | 95℃ | 1 à 5 min | 1 |
| Dénaturation | 95℃ | 10-20 s | 40-50 |
| recuit et extension | 56-64 °C | 20-60 s | |
| RapideProgramme PCR | |||
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Digestion | 50 °C | 2 min | 1 |
| Démarrage à chaud | 95℃ | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 95℃ | 1-3 s | 40-45 |
| recuit et extension | 56-64 °C | 3-20 s | |
Contrôle de qualité
1. Tests fonctionnels : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qPCR.
2. Exempt d'activité nucléasique exogène, ainsi que de contamination par des endonucléases et des exonucléases exogènes.
Description technique
1. Le taux d'amplification de l'ADN polymérase rapide contenue dans ce produit est d'au moins 1 kb/10 s. Des variations importantes existent au niveau de la vitesse de montée en température, du mode de contrôle de la température et de l'efficacité du transfert de chaleur selon les appareils de PCR. Lors de l'utilisation de ce réactif, il convient de déterminer les paramètres de réaction optimaux pour l'appareil de PCR rapide utilisé.
2. Si des problèmes tels que de faibles valeurs de fluorescence ou une inhibition d'amplification significative surviennent, il est recommandé de réduire le volume de l'échantillon ou de diluer l'échantillon avant de l'ajouter au système de réaction ; alternativement, le problème peut être amélioré en augmentant le volume de réaction (60 à 100 µL) tout en gardant le volume de l'échantillon inchangé.
3. Le prélèvement d'échantillons tels que le sang et les écouvillons de gorge mentionnés ci-dessus doit être effectué conformément aux procédures opératoires standard (POS) cliniques ; pour éviter la dégradation des acides nucléiques, il est recommandé d'utiliser des échantillons fraîchement prélevés.
4. Pour les amorces avec des températures d'hybridation basses ou l'amplification de longs fragments dépassant 200 pb, le protocole PCR en trois étapes est recommandé.
5. L’efficacité d’utilisation du dUTP et la sensibilité à l’enzyme UNG varient selon les gènes cibles. Par conséquent, si l’utilisation du système UNG entraîne une diminution de la sensibilité de détection, le système réactionnel doit être ajusté et optimisé en conséquence.
6. Utilisez des zones et des pipettes dédiées aux étapes de pré- et post-amplification. Manipulez les produits de PCR avec des gants et changez-les fréquemment. N’ouvrez pas les tubes de réaction après la PCR afin de minimiser la contamination des échantillons par les produits d’amplification.
7. À usage de recherche uniquement !