Prémélange FastDirect Probe RT-qPCR plus-UNG HYA433
détails du produit
Le prémix FastDirect Probe RT-qPCR plus-UNG est un réactif spécialisé conçu pour la détection quantitative directe par fluorescence (sonde TaqMan) de l'amplification de l'ARN de gènes cibles, éliminant ainsi le besoin d'extraction et de purification des acides nucléiques à partir des échantillons. Il contient une transcriptase inverse et une ADN polymérase à amplification rapide, génétiquement modifiées et sélectionnées, permettant de réaliser les réactions PCR en 20 à 40 minutes. Ce produit présente une forte tolérance aux inhibiteurs, permettant la détection directe de l'amplification de l'ARN à partir d'échantillons tels que le sang total anticoagulé, le plasma, le sérum, les écouvillons de gorge et les selles, sans extraction ni purification préalable des acides nucléiques. Formulé avec un tampon optimisé spécifique à la qPCR et un système anti-contamination UNG/dUTP, ce réactif prévient efficacement les faux positifs dus à la contamination par des résidus de produits PCR et par aérosols.
Composants
1. Mélange RTase/UNG direct 10×
2. Tampon de prémélange direct RT 2×Fast (dUTP)
Stockage
Conserver à -20 °C pour une conservation à long terme. Bien mélanger avant utilisation et éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
Instructions
1. Système réactionnel
| Composants | 25 µL Volume | 50 µL Volume | Concentration finale |
| Tampon de prémélange direct RT 2×Fast (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| Mélange RTase/UNG direct 10× | 2,5 µL | 5 µL | 1× |
| Mélange amorce-sonde 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN matrice** | - | - | - |
| DEPC H2LE | Jusqu'à 25 µL | Jusqu'à 50 µL | - |
Lors de l'utilisation de protocoles PCR conventionnels, une concentration finale d'amorces de 0,2 μM donne généralement des résultats satisfaisants. Si la réaction ne donne pas de résultats satisfaisants, la concentration d'amorces peut être ajustée entre 0,2 et 1 μM. La concentration de sonde est généralement optimale entre 0,1 et 0,3 μM. Des expériences de gradient de concentration peuvent être réalisées pour identifier la combinaison optimale d'amorces et de sondes. Lors de l'utilisation de protocoles PCR rapides, une augmentation appropriée des concentrations d'amorces et de sondes peut améliorer les résultats d'amplification, et le rapport amorces/sondes doit être optimisé.
Les types et les concentrations d'inhibiteurs, ainsi que le nombre de copies des gènes cibles, varient selon les types d'échantillons biologiques. L'impact des différentes solutions de conservation (par exemple, les solutions de conservation pour écouvillons) sur les performances d'amplification est également variable. Par conséquent, le volume optimal d'échantillon dans le système de réaction doit être déterminé en fonction des conditions réelles, telles que le type d'échantillon et les exigences de sensibilité de détection. Si nécessaire, l'échantillon peut être dilué avec de l'eau sans nucléase ou du tampon TE avant d'être ajouté au système de réaction. Les volumes d'échantillon recommandés sont les suivants :
| Type d'échantillon | Volume ajouté pour 50 Système de réaction µL | Ajout maximum Rapport d'échantillonnage |
| Sang entier | 2,5 µL | 5% |
| Prélèvement de gorge | 10 µL | 20% |
2. Programme de réaction
| PCR régulière programme | |||
| Sétape | Ttempérature | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50℃ | 10-20 min | 1 |
| Prédénaturation | 95℃ | 1 à 5 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10-20 s | 40-50 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 20-60 s | |
| RputainPCR programme | |||
| Sétape | Ttempérature | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50℃ | 5 min | 1 |
| Prédénaturation | 95℃ | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 1-3 s | 40-45 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 3-20 s | |
Contrôle de qualité
1. Tests fonctionnels : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qRT-PCR.
2. Exempt d'activité nucléasique exogène, ainsi que de contamination par des endonucléases et des exonucléases exogènes.
Informations techniquesrmation
1. Le taux d'amplification de l'ADN polymérase contenue dans ce produit est d'au moins 1 kb/10 s. Des variations importantes existent entre les différents appareils de PCR concernant la vitesse de montée en température, le mode de contrôle de la température et l'efficacité du transfert de chaleur. Il est recommandé d'optimiser les paramètres de réaction en fonction de l'appareil de PCR rapide utilisé.
2. Si des problèmes tels que de faibles valeurs de fluorescence ou une inhibition significative de l'amplification surviennent, il est recommandé de réduire le volume de l'échantillon ou de diluer l'échantillon avant de l'ajouter au système de réaction.
3. Le prélèvement d'échantillons tels que le sang, les écouvillons de gorge et les selles mentionnés ci-dessus doit être effectué conformément aux procédures opératoires standard (POS) cliniques ; pour éviter la dégradation des acides nucléiques, il est recommandé d'utiliser des échantillons fraîchement prélevés.
4. La durée de la transcription inverse doit être optimisée en fonction de la longueur des fragments cibles ; une durée de transcription inverse prolongée est recommandée pour les fragments plus longs.
5. La température d'hybridation-extension doit être optimisée en fonction des valeurs Tm des amorces et des sondes, ainsi que des conditions de réaction réelles.
6. Pour les amorces avec des températures d'hybridation basses ou l'amplification de longs fragments dépassant 200 pb, le protocole PCR en trois étapes est recommandé.
7. L'efficacité d'utilisation du dUTP et la sensibilité à l'enzyme UNG varient selon les gènes cibles. Par conséquent, si l'utilisation du système UNG entraîne une diminution de la sensibilité de détection, le système réactionnel doit être ajusté et optimisé en conséquence. Pour toute assistance technique, veuillez contacter notre société.
8. Utilisez des zones et des pipettes dédiées aux étapes de pré- et post-amplification. Manipulez les produits de PCR avec des gants et changez-les fréquemment. N’ouvrez pas les tubes de réaction après la PCR afin de minimiser la contamination des échantillons par les produits d’amplification.
9. À usage de recherche uniquement !