Kit de préparation de bibliothèques d'ADN Fast Tagment pour Illumina (pour 1 ng) HYD121
Le kit Fast Tagment DNA Library Prep pour Illumina (pour 1 ng) est un kit de construction de bibliothèque basé sur la transposase, spécialement développé pour Illumina.®Plateforme de séquençage à haut débit. Elle est adaptée à la construction de bibliothèques à partir de 1 ng d'ADN génomique, d'ADNc, d'amplicons (> 500 pb) et d'autres échantillons. Comparé à la méthode classique de construction de bibliothèques étape par étape, le kit Fast Tagment DNA Library Prep pour Illumina utilise une nouvelle transposase et un système tampon optimisé pour réaliser la fragmentation de l'ADN, la réparation des extrémités et la ligation des adaptateurs en seulement 10 minutes, réduisant ainsi considérablement le temps de construction à moins d'une heure et demie et garantissant une excellente qualité de séquençage. De plus, ce kit a été validé pour des échantillons d'ADN présentant différentes teneurs en GC, sans préférence ou avec une préférence très faible. Tous les composants de ce kit ont subi des contrôles qualité et fonctionnels rigoureux afin de garantir une performance optimale et une stabilité maximale d'un lot à l'autre.
Composants
| Composants | 24T | 96T |
| Tampon de réaction 5× | 96 μL | 384 μL |
| Mélange transposome V1 | 120 μL | 480 μL |
| Mélange d'amorces PCR | 72 μL | 288 μL |
| Mix d'amplification 2×Ultima | 600 μL | 2 × 2400 μL |
| T5 (T501)* | - | - |
| T7 (T701)* | - | - |
| T7 (T702)* | - | - |
*Séquence d'index lors du séquençage : T501-CTCTCTAT (NovaSeq 6000 v1.0) ou ATAGAGAG (NovaSeq 6000 v1.5), T701-TAAGGCGA, T702-CGTACTAG.
Conditions de stockage
À conserver à -25~-15℃ pendant 1 an.
Notes
À propos de l'opération
1. Veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables pour votre sécurité.
2. Décongeler les composants à température ambiante. Après décongélation, bien mélanger par vortexage, agiter brièvement le tube et placer le tout sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
3. Lors de la préparation de la solution réactionnelle de chaque étape, il est recommandé d'utiliser une pipette pour bien mélanger ou, en douceur, de mélanger. Une agitation vigoureuse peut entraîner une diminution du rendement de la bibliothèque.
4. Il est fortement recommandé d'utiliser des embouts de pipettes filtrants afin d'éviter toute contamination croisée. Veillez à changer d'embout de pipette lors du traitement de différents échantillons.
5. Des manipulations incorrectes peuvent entraîner une contamination par aérosol, affectant ainsi la précision des résultats. L'isolation physique obligatoire des zones de mélange des réactions PCR et des zones d'analyse de purification des produits PCR est recommandée. Utiliser du matériel tel que des pipettes spécialisées pour la préparation des banques d'ADN. Nettoyer régulièrement chaque zone en essuyant les surfaces avec une solution d'hypochlorite de sodium à 0,5 % ou d'eau de Javel à 10 %.
6. Ce produit est destiné à la recherche uniquement.
À propos du principe du produit
Ce produit est développé selon la méthode de la transposase, dont le principe fondamental repose sur la transposase et son mécanisme de transposition. Le mélange de transposons contient un transposon complet composé de la transposase et de deux adaptateurs équimolaires, Adaptateur 1 et Adaptateur 2. Lors de la transposition, le transposon insère les séquences adaptatrices des Adaptateurs 1 et 2 dans le gène cible, formant un fragment d'ADN avec l'Adaptateur 1 à une extrémité et l'Adaptateur 2 à l'autre. L'ADN polymérase est ensuite utilisée pour combler l'incision créée par la transposition. Ce produit est amplifié par deux paires d'amorces : N5 (N5XX) et N7 (N7XX), et P5 et P7 (mélange d'amorces PCR). Après tri et purification, le produit constitue une banque d'ADN séquençable.
Fragmentation de l'ADN
1. Ce kit utilise une transposase pour la fragmentation de l'ADN. Si l'échantillon d'ADN est un produit de PCR, sa longueur doit être supérieure à 500 pb. La transposase étant inactive aux extrémités de l'ADN, la couverture de séquençage des 50 derniers nucléotides du produit de PCR peut être réduite. Nous vous recommandons d'étendre les deux extrémités de la région à analyser de 50 à 100 pb lors de la préparation du produit de PCR afin d'éviter une réduction de la couverture de séquençage terminale.
2. Ce kit est adapté à 1 ng d'ADN d'entrée. Avant l'ajout de l'ADN d'entrée, celui-ci doit être purifié et dissous dans de l'eau distillée stérile (A260/A280 = 1,8-2,0), puis quantifié par une méthode de dosage fluorescent de l'ADN double brin, telle que Qubit® ou PicoGreen®. Remarque : Le mélange de transposomes étant très sensible à la concentration d'ADN, une détermination précise de cette concentration est essentielle à la réussite de l'expérience.
Purification et sélection de taille de l'ADN à l'aide de billes
1. Les billes magnétiques doivent être équilibrées à température ambiante avant utilisation, sinon le rendement diminuera et l'effet de sélection de taille sera affecté.
2. Les billes magnétiques doivent être bien mélangées par vortex ou pipetage avant utilisation.
3. Ne pas aspirer les billes lors du transfert du surnageant, même des traces de billes peuvent avoir un impact sur les réactions suivantes.
4. L'éthanol à 80 % doit être fraîchement préparé, sinon cela affectera l'efficacité de la récupération.
5. Pour un choix de taille précis, il est recommandé de commencer avec un volume supérieur à 100 μL. Si le volume est inférieur, il est recommandé de le compléter à 100 μL avec de l'eau ultrapure.
6. Les billes magnétiques doivent être séchées à température ambiante avant l'élution du produit. Un séchage insuffisant peut entraîner la présence de résidus d'éthanol susceptibles d'affecter les réactions suivantes ; un séchage excessif peut provoquer la fissuration des billes et réduire le rendement de purification. En général, un séchage à température ambiante pendant 3 à 5 minutes suffit pour que les billes soient complètement sèches.
7. Si nécessaire, les échantillons d'ADN purifiés ou sélectionnés en fonction de leur taille, élués dans un tampon TE 0,1×, peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 à 2 semaines ou à -20 °C pendant un mois.
Amplification de la bibliothèque
1. L'étape d'amplification de la bibliothèque est nécessaire lors de l'utilisation de ce kit. Le produit de la réaction de transposition ne constituant pas une bibliothèque d'ADN double brin complète, une bibliothèque d'ADN complète doit être générée par PCR.
2. Lorsque la quantité d'ADN d'entrée est de 1 ng, 8 à 15 cycles d'amplification sont recommandés, et la sortie de la bibliothèque de 13 cycles est d'environ 600 ng.
Analyse de la qualité des bibliothèques
1. La qualité des bibliothèques construites est généralement analysée en mesurant les concentrations et les distributions de taille.
2. Les concentrations des bibliothèques peuvent être mesurées par des méthodes basées sur la fluorescence telles que Qubit®et PicoGreen®ou
3. L'utilisation de méthodes de quantification basées sur l'absorbance, telles que NanoDrop, est déconseillée.®.
4. Il est recommandé d'utiliser la méthode qPCR pour la quantification de la bibliothèque : les méthodes basées sur la fluorescence telles que Qubit®et PicoGreen®Il est impossible de différencier les structures d'ADN double brin incomplètes (inserts sans adaptateur ou avec une seule extrémité ligaturée à un adaptateur) des banques complètes. La méthode qPCR amplifie et mesure uniquement les banques complètes, dont les deux extrémités sont ligaturées à des adaptateurs (les banques séquencables), ce qui permet une mesure plus précise du chargement.
5. La distribution de taille des bibliothèques peut être analysée à l'aide de l'Agilent Bioanalyzer ou d'autres dispositifs basés sur les principes de l'électrophorèse capillaire ou de la microfluidique.
Autre Matériels
1. Billes magnétiques de purification d'ADN : billes de sélection d'ADN NGS ou billes AMPure XP ou autres produits équivalents.
2. Analyse de la qualité de la bibliothèque : Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer ou autres produits équivalents.
3. Amorce d'index N5 (N5XX) et N7 (N7XX) : Kit d'index Tagment NGS pour Illumina.
4. Autres matériaux : éthanol absolu, eau ultrapure stérile, tampon TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0-8,5 + EDTA 1 mM), embouts de pipettes à faible rétention, tube PCR, supports magnétiques, thermocycleur, etc.