Prémélange qPCR FastAmpli Probe plus-UNG HYA423
détails du produit
Le prémix FastAmpli Probe qPCR plus-UNG est un réactif spécialisé pour les réactions de PCR en temps réel (RT-qPCR) qualitatives et quantitatives utilisant la méthode par sonde. Il contient une ADN polymérase à amplification rapide, génétiquement modifiée et sélectionnée, permettant de réaliser les réactions PCR en moins de 30 minutes. Grâce à l'optimisation du système tampon, ce produit est adapté à l'amplification multiplex. Formulé avec un mélange d'enzyme d'amplification résistante aux inhibitions et d'enzyme UNG, ainsi qu'un système tampon optimisé contenant du dUTP, ce réactif permet non seulement une amplification efficace des gènes cibles dans les échantillons contenant des inhibiteurs, mais prévient également efficacement les faux positifs dus à la contamination par des résidus de produits PCR et par des aérosols. Il est compatible avec les instruments de PCR en temps réel de la plupart des fabricants, notamment Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad et Roche.
Composants
Prémélange qPCR FastAmpli Probe 2×plus-UNG
Ce réactif contient déjà des composants tels que l'ADN polymérase à démarrage à chaud, l'UNG, le tampon PCR et le MgCl₂.2, les dNTP et les stabilisateurs.
Stockage
À conserver à -20 °C pour une conservation à long terme ; stable pendant 3 mois à 4 °C. Bien mélanger avant utilisation et éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
Instructions
1. Système réactionnel
| Composants | 25 µL Volume | Volume de 50 µL | Concentration finale |
| Prémélange qPCR FastAmpli Probe 2×plus-UNG | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| Mélange amorce-sonde 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ADN matrice** | - | - | - |
| ddH2LE | Jusqu'à 25 µL | Jusqu'à 50 µL | - |
Lors de l'utilisation de protocoles PCR conventionnels, une concentration finale d'amorces de 0,2 μM donne généralement des résultats satisfaisants. Si les performances de la réaction sont insuffisantes, la concentration d'amorces peut être ajustée entre 0,2 et 1 μM. La concentration de sonde est généralement optimale entre 0,1 et 0,3 μM. Des expériences de gradient de concentration peuvent être réalisées afin d'identifier la combinaison optimale d'amorces et de sondes. Lors de l'utilisation de protocoles PCR rapides, une augmentation appropriée des concentrations d'amorces et de sondes peut améliorer les résultats d'amplification, et le rapport amorces/sondes doit être optimisé.
Le nombre de copies du gène cible varie selon le type de matrice. Si nécessaire, des dilutions en série peuvent être effectuées pour déterminer la quantité optimale de matrice à ajouter.
2. Programme de réaction
| PCR régulière programme | |||
| Sétape | Ttempérature | Temps | Cycles |
| Digestion | 50℃ | 2 min | 1 |
| Prédénaturation | 95℃ | 1 à 5 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10-20 s | 40-50 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 20-60 s | |
| RputainPCR programme | |||
| Sétape | Ttempérature | Temps | Cycles |
| Digestion | 50℃ | 2 min | 1 |
| Prédénaturation | 95℃ | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 1-3 s | 40-45 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 3-20 s | |
Contrôle de qualité
- Tests fonctionnels : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qPCR.
- Exempte d'activité nucléasique exogène, ainsi que de contamination par des endonucléases et des exonucléases exogènes.
Informations techniquesrmation
1. Le taux d'amplification de l'ADN polymérase rapide contenue dans ce produit est d'au moins 1 kb/10 s. Des variations importantes existent au niveau de la vitesse de montée en température, du mode de contrôle de la température et de l'efficacité du transfert de chaleur entre les différents appareils de PCR rapide. Il est recommandé d'optimiser les paramètres de réaction en fonction de l'appareil de PCR rapide utilisé.
2. Il présente une spécificité accrue et améliore considérablement la sensibilité de détection en PCR en temps réel. Il en résulte une nette amélioration de la normalisation des courbes d'amplification et des valeurs de fluorescence pour les matrices à très faible concentration, ce qui le rend adapté à une utilisation comme réactif de détection en PCR en temps réel haute sensibilité.
3. Pour les amorces avec des températures d'hybridation basses ou l'amplification de longs fragments dépassant 200 pb, le protocole PCR en trois étapes est recommandé.
4. L’efficacité d’utilisation du dUTP et la sensibilité à l’enzyme UNG varient selon les gènes cibles. Par conséquent, si l’utilisation du système UNG entraîne une diminution de la sensibilité de détection, le système réactionnel doit être ajusté et optimisé en conséquence.
5. Utilisez des zones et des pipettes dédiées aux étapes de pré- et post-amplification. Portez des gants et changez-les fréquemment. N’ouvrez pas les tubes de réaction après la PCR afin de minimiser la contamination des échantillons par les produits d’amplification.
6. À usage de recherche uniquement !