Prémélange RT-qPCR multiplex en une étape - UNG M2 HYA437
détails du produit
Le prémix RT-qPCR multiplex One Step UNG M2 est un réactif dédié aux réactions qualitatives et quantitatives par RT-PCR en une étape avec sonde fluorescente, en amplification multiplex. La réaction se déroule en continu dans un seul tube, sans ouverture, ce qui prévient efficacement toute contamination. Ce produit contient une transcriptase inverse thermostable à activité RNase H éliminée et une Taq ADN polymérase hot-start génétiquement modifiée, offrant une efficacité de transcription inverse et d'amplification PCR supérieure. Il est adapté à l'amplification haute sensibilité de matrices d'ARN à faible concentration. Formulé avec un tampon optimisé spécifique à la qPCR et le système de prévention de la contamination UNG/dUTP, ce réactif génère une courbe standard de haute qualité sur une large gamme de quantification pour une quantification précise. Il inhibe également efficacement les faux positifs dus aux résidus de PCR et à la contamination par aérosol. Ce réactif est compatible avec les instruments de qPCR fluorescents en temps réel de la plupart des fabricants, notamment Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad et Roche.
Composants
1. Mélange multiple RTase/UNG 20×
2. Tampon multiple prémélangé 8×RT (dUTP) (Mg2+gratuit)
3. 360 mM MgCl2
Stockage
Pour une conservation à long terme, conserver à -20 °C. Stable pendant 3 mois à 4 °C. Bien mélanger avant utilisation. Éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
Instructions
1. Préparation du système de réaction qRT-PCR
| Composants | Volume de 25 µL | Volume de 50 µL | Concentration finale |
| Tampon multiple prémélangé 8×RT (dUTP) (Mg2+gratuit) | 3,125 µL | 6,25 µL | 1× |
| 20× RTase/UNG Multi Mix | 1,25 µL | 2,5 µL | 1× |
| 360 mM MgCl2 | 0,417 µL | 0,833 µL | 6 mM |
| Mélange amorce-sonde 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN matrice** | —— | —— | —— |
| ddH2LE | À 25 µL | À 50 µL | —— |
Une concentration finale d'amorces de 0,2 μM donne généralement des résultats optimaux. Si la réaction n'est pas optimale, ajustez la concentration d'amorces entre 0,2 et 1 μM. La concentration de sonde est généralement optimale entre 0,1 et 0,3 μM. Des expériences de gradient de concentration peuvent être réalisées pour identifier la combinaison optimale d'amorces et de sondes.
Le nombre de copies du gène cible varie selon le type de matrice d'ARN. Une dilution en série peut être effectuée si nécessaire pour déterminer la quantité optimale de matrice d'ARN à ajouter.
2. Programme de réaction
| Programme PCR régulier | |||
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50℃ | 10-20 min | 1 |
| Prédénaturation | 95℃ | 1 à 5 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10-20 s | 40-50 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 20-60 s | |
Contrôle de qualité
1. Tests fonctionnels : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qRT-PCR.
2. Exempt d'activité nucléasique exogène, ainsi que de contamination par des endonucléases et des exonucléases exogènes.
Informations techniques
1. Ce système contient l'enzyme TS-UNG, qui peut dégrader les matrices d'ADN contenant de l'uracile à température ambiante (TA) ou à 25 °C, et est inactivée pendant la transcription inverse, n'affectant ainsi pas l'amplification PCR ultérieure utilisant l'ADNc comme matrice.
2. La réaction de transcription inverse de ce système est généralement réalisée à 50 °C. La température de transcription inverse peut être optimisée entre 42 et 55 °C ; selon les caractéristiques de la réaction, la durée de transcription inverse peut être optimisée entre 5 et 30 minutes.
3. La transcriptase inverse utilisée dans ce système est génétiquement modifiée à partir du M-MLV, ce qui lui confère une tolérance thermique et une température de transcription inverse plus élevées. Elle présente une efficacité de transcription inverse supérieure pour les matrices d'ARN à structure complexe.
4. Ce système présente une excellente stabilité et une grande applicabilité, ce qui le rend particulièrement adapté à la détection de matrices complexes telles que l'ARN viral et l'ARN extrait de tissus. Il offre une amplification plus stable pour des matrices à très faible concentration et convient à une utilisation dans des réactifs de diagnostic moléculaire à haute sensibilité.
5. Pour les amorces avec une température d'hybridation basse ou l'amplification de longs fragments dépassant 200 pb, le protocole PCR en trois étapes est recommandé.
6. L'efficacité d'utilisation du dUTP et la sensibilité à l'enzyme UNG varient selon les gènes cibles. Par conséquent, si l'utilisation du système UNG entraîne une diminution de la sensibilité de détection, le système réactionnel doit être ajusté et optimisé.
7. Utilisez des zones et des pipettes dédiées avant et après l'amplification. Portez des gants et changez-les fréquemment. N'ouvrez pas les tubes de réaction après la PCR afin de minimiser la contamination des échantillons par les produits de PCR.
8. À usage de recherche uniquement !