Transcriptase inverse M-MLV (sans glycérol) HYA213
Ce produit est dérivé du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV), une ADN polymérase ARN-dépendante dépourvue d'activité exonucléase 3'→5' et dont l'activité RNase H a été supprimée par mutation. Cette enzyme est une nouvelle transcriptase inverse obtenue par de multiples mutations ponctuelles à partir de M-MLV (RNase H-). Elle résiste à une température de réaction de 50 °C et peut être utilisée pour la transcription inverse de matrices d'ARN présentant des structures secondaires afin d'améliorer l'affinité pour la matrice. Ce produit peut être utilisé pour la synthèse d'ADNc de premier brin et de second brin, l'extension d'amorces d'ARN, la RT-PCR, la RT-qPCR et la construction de banques d'ADNc.
Composants
| Composant | 10 KU | 100 KU | 2000 KU |
| 200 U/μL de transcriptase inverse M-MLV (sans glycérol) | 0,05 mL | 0,5 mL | 10 mL |
| Tampon de transcriptase inverse 5× | 0,5 mL | 5 mL | 10 × 10 mL |
Stockage
Conserver entre -25°C et -15°C.
Définition de l'unité
1 unité d'activité (U) est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour convertir 1 nmol de dTTP en substances insolubles dans l'acide à 37°C pendant 10 min en utilisant Poly (rA)·Oligo (dT) comme matrice/amorce.
Contrôle de qualité
1. Pureté des protéines(SDS-PAGE) : ≥95 % ;
2. Résidu d'endonucléase: 200 U de ce produit et 1 μg d'ADN λ ont réagi à 37℃ pendant 16 heures, et la bande électrophorétique de l'ADN n'a pas changé ;
3. Résidu d'exonucléase: 200 U de ce produit et 1 μg d'ADN digéré par λ-HindIII ont réagi à 37℃ pendant 16 heures, et la bande électrophorétique de l'ADN n'a pas changé ;
4. Résidu de RNase: 200 U de ce produit et 1,6 μg d'ARN MS2 ont réagi à 37℃ pendant 4 heures, et la bande électrophorétique de l'ARN n'a pas changé ;
5. E. coli résidu du génomeL'acide nucléique résiduel dans 600 U de ce produit a été détecté par qPCR TaqMan spécifique àE. coliL'ADNr 16S et le E. coli le résidu génomique était inférieur à 10 copies ;
Instructions
1. Système réactionnel
| Composants | Volume |
| ARN matrice* | facultatif |
| Oligo(dT)18 (50 µM) ou mélange d'amorces aléatoires (50 ng/µL) | 1 μL |
| Mélange de dNTP (10 mM chacun) | 1 μL |
| Inhibiteur de RNase (40U/µL) | 1 μL |
| 200 U/μL de transcriptase inverse M-MLV (sans glycérol) | 1 μL |
| Tampon de transcriptase inverse 5× | 4 μL |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 20 μL |
*La quantité d'ARN matrice ajoutée est indiquée dans le tableau suivant
| ARN total | 10 pg ~ 5 μg |
| ARN poly(A) | 10 pg~500ng |
2. Réaction Programme
| Température | Temps |
| 25 °C* | 5 minutes |
| 50 °C** | 45 min*** |
| 85 °C | 2 min |
*Si vous utilisez un mélange d'amorces aléatoires, ajoutez cette étape d'incubation ; omettez cette étape si vous utilisez Oligo(dT).18ou amorce spécifique au gène.
**Si le modèle possède une structure secondaire complexe ou une région GC élevée, la température de réaction peut être augmentée à 55℃ pour aider à augmenter le rendement.
***Prolonger la durée de la transcription inverse peut permettre d'obtenir des ADNc plus longs (>5 kb).
Notes
1. Afin de prévenir toute contamination par la RNase, veuillez maintenir la zone expérimentale propre et porter des gants et un masque propres lors de la manipulation. Les consommables utilisés, tels que les tubes à centrifuger et les embouts de pipettes, doivent être exempts de RNase.
2. Les produits d'ADNc peuvent être stockés à -20℃ ou -80℃ ou utilisés immédiatement pour les réactions PCR (qPCR).
3. Il est recommandé que le volume de produits d'ADNc utilisés pour les réactions PCR (qPCR) ne dépasse pas 1/10 du volume de la réaction PCR.