Transcriptase inverse M-MLV M2 HYA212
La transcriptase inverse M2 du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV) est une transcriptase inverse obtenue par criblage de mutations du gène M-MLV et expression dans *E. coli*. Cette enzyme, dépourvue d'activité RNase H, présente une tolérance thermique accrue. Elle est particulièrement adaptée à la transcription inverse à haute température, ce qui permet de s'affranchir des effets néfastes de la structure complexe de l'ARN et des facteurs non spécifiques sur la synthèse d'ADNc. Elle offre ainsi une stabilité et une capacité de synthèse par transcription inverse supérieures.
Composants
1. 200 U/µL de transcriptase inverse M-MLV M2
2. Tampon de transcriptase inverse 5×M-MLV (facultatif)
Le tampon de transcriptase inverse 5×M-MLV ne contient pas de dNTP. Veuillez ajouter les dNTP lors de la préparation du système réactionnel.
Stockage
Conserver entre -25°C et -15°C.
Définition de l'unité
1 unité d'activité (U) est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour convertir 1 nmol de dTTP en substances insolubles dans l'acide à 37°C pendant 10 min en utilisant Poly (rA)·Oligo (dT) comme matrice/amorce.
Contrôle de qualité
1. Pureté >98% déterminée par électrophorèse SDS-PAGE.
2. Sensibilité à l'amplification, variation d'un lot à l'autre et stabilité.
3. Exempt d'activité nucléasique exogène ; aucune contamination par des endonucléases ou des exonucléases exogènes.
Instructions
1. Reportez-vous au tableau ci-dessous pour préparer le système.
| Composants | Volume |
| ARN matrice | ARN total ≤ 5 µg ; ARNm ≤ 1 µg |
| Oligo(dT)12-18D'abord* | 50 pmol |
| OuAmorce aléatoire * | 50 pmol (20 à 100 pmol) |
| OuAmorce spécifique au gène * | 2 pmol |
| dNTP (10 mM chacun) | 1 μL |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 10 μL |
*Choisissez différents types d'amorces en fonction des besoins expérimentaux.
2. Chauffer à 65℃ pendant 5 min, puis refroidir rapidement sur de la glace pendant 2 min ;
3. Ajouter les composants suivants au système ci-dessus pour obtenir un volume total de 20 µL et mélanger délicatement.
| Composants | Volume |
| Tampon de transcriptase inverse 5×M-MLV | 4 µL |
| 200 U/µL de transcriptase inverse M-MLV M2 | 1 µL |
| Inhibiteur de RNase à 40 U/µL | 1 µL |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 20 μL |
4. Effectuez la réaction dans les conditions suivantes.
1) Si vous utilisez une amorce aléatoire, incubez d'abord à 25℃ pendant 10 min ; puis incubez à 50℃ pendant 30 à 60 min ;
2) Si vous utilisez Oligo dT ou des amorces spécifiques, incubez à 50℃ pendant 30 à 60 min.
5. Inactiver la transcriptase inverse M-MLV en chauffant à 95℃ pendant 5 min et arrêter la réaction.
6. Le produit de transcription inverse peut être utilisé directement pour la réaction PCR et la réaction PCR quantitative par fluorescence, ou stocké à -20℃ pendant une longue période.
Description technique
1. Convient pour l'optimisation de la température de transcription inverse dans la plage de 42℃~55℃.
2. Grâce à sa meilleure stabilité, il convient à l'amplification par transcription inverse à haute température, ce qui permet de traverser efficacement la zone de structure complexe de l'ARN et convient à la détection quantitative par RT-PCR à fluorescence multiplex en une seule étape.
3. Il présente une bonne compatibilité avec diverses enzymes d'amplification PCR et convient aux réactions RT-PCR à haute sensibilité.
4. Il convient aux réactions RT-PCR quantitatives par fluorescence en une étape à haute sensibilité, améliorant efficacement le taux de détection des matrices à faible concentration.
5. Il convient à la construction de banques d'ADNc.
6. COURSE DE 3' ET 5'.