ARNm Cap2'-O-Méthyltransférase--HYJ232
La méthyltransférase de coiffe d'ARNm (mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase) est issue d'une souche recombinante d'Escherichia coli portant le gène de la méthyltransférase de coiffe d'ARNm du virus de la vaccine. Cette enzyme ajoute un groupe méthyle en position 2'-O du premier nucléotide précédant immédiatement la coiffe à l'extrémité 5' de l'ARN. Elle peut également méthyler l'ARN coiffé (Coiffe 0) en utilisant la S-adénosylméthionine (SAM) comme donneur de méthyle, formant ainsi une coiffe de type 1 (Coiffe 1). Cette dernière améliore l'efficacité de la traduction de l'ARNm et peut donc contribuer à optimiser son expression lors d'expériences de transfection et de micro-injection. Cette enzyme nécessite comme substrat un ARN coiffé de 7-méthylguanosine (m7GpppN) et est insensible aux ARN contenant pN, ppN, pppN ou GpppN à l'extrémité 5'. L'ARN coiffé peut être préparé par transcription in vitro à l'aide d'un analogue de coiffage ou coiffé enzymatiquement à l'aide de l'enzyme de coiffage de la vaccine.
Composants
| Composants | 2,5 KU | 10KU | 50KU | 500KU | 5000KU |
| ARNm Cap2'-O-Méthyltransférase (50 U/μL) | 0,05 mL | 0,2 mL | 1 mL | 10 mL | 100 mL |
| Tampon de plaquage 10× | 0,1 mL | 0,4 mL | 2×1 mL | 2 × 10 mL | 2×100mL |
Stockage
À conserver entre -25 et -15 °C. Se conserve 2 ans (éviter les cycles de congélation-décongélation répétés).
tampon de stockage
20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glycérol.
Définition de l'activité
Une unité (U) d'activité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour méthyler 10 pmol de transcrit d'ARN coiffé de 80 nt en 1 heure à 37 °C.
Contrôle de qualité
- Activité exonucléasique : Lorsque 50 U de ce produit ont réagi avec 1 μg d'ADN digéré par λ-Hind III à 37 °C pendant 16 heures, la bande électrophorétique de l'ADN est restée inchangée.
- Activité endonucléasique : Lorsque 50 U de ce produit ont réagi avec 1 μg d'ADN λ à 37 °C pendant 16 heures, la bande électrophorétique de l'ADN est restée inchangée.
- Activité de la nickase : Lorsque 50 U de ce produit ont réagi avec 1 μg de pBR322 à 37 °C pendant 16 heures, la bande électrophorétique de l'ADN est restée inchangée.
- Activité RNase : Lorsque 50 U de ce produit ont réagi avec 1,6 μg d'ARN MS2 à 37 °C pendant 4 heures, la bande électrophorétique de l'ARN est restée inchangée.
- ADN résiduel d'E. coli : Des acides nucléiques résiduels dans 50 U de ce produit ont été détectés par qPCR TaqMan spécifique de l'ADNr 16S d'E. coli, et le génome résiduel d'E. coli était ≤1 copie.
- Endotoxine: Test LAL, Pharmacopée chinoise édition 2020 Partie IV Règles générales du test de limite de gel (1143), teneur en endotoxines bactériennes ≤ 10 UE/mg.
Système réactionnel et conditions
- Diluer la quantité appropriée d'ARN coiffé à 16 μL avec de l'eau sans RNase.
- Chauffer l'ARN dilué à 65 °C pendant 5 minutes, puis le placer sur de la glace pendant 5 minutes.
- Préparer le mélange réactionnel selon le tableau suivant (applicable aux réactions de méthylation jusqu'à 10 μg d'ARN coiffé) :
| Composants | Volume |
| ARN coiffé dénaturé | 16 µL |
| Tampon de plaquage 10×* | 2 µL |
| SAM (4 mM) | 1 µL |
| ARNm Cap2'-O-Méthyltransférase (50 U/μL) | 1 µL |
| ddH2LE | Jusqu'à 20 µL |
*10× Tampon de coiffage : Tris-HCl 500 mM (pH 8,0, 25 °C), KCl 50 mM, MgCl₂ 10 mM, DTT 10 mM.
4. Incuber à 37 °C pendant 1 heure (pour les cibles d'ARN de moins de 200 nt de longueur, augmenter le temps d'incubation à 2 heures).
Applications
Améliorer l'expression de l'ARNm dans les expériences de micro-injection et de transfection.
Notes
- Avant de commencer la réaction, l'ARN doit être purifié et dissous dans de l'eau exempte de nucléases. Toutes les solutions doivent être exemptes d'EDTA et d'ions de sel.
- Avant la réaction, il est recommandé de chauffer l'ARN échantillon à 65 °C pendant 5 minutes afin d'éliminer les structures secondaires à l'extrémité 5' du transcrit. Si cette extrémité est complexe, la durée de chauffage peut être portée à 10 minutes.
- Le réactif SAM est moins stable à pH 7–8 et à 37 °C et doit être préparé juste avant utilisation. Vous pouvez précalculer la quantité de SAM nécessaire et diluer la solution mère de SAM à 32 mM à une solution de travail à 4 mM avant la réaction. Pour éviter la dégradation du SAM, la solution de travail doit être conservée sur glace.
- Pour votre sécurité et votre bien-être, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant cette procédure.