RobuDirect Probe RT-qPCR Premix plus-UNG HYA439-0225
détails du produit
Le prémix RT-qPCR RobuDirect Probe plus-UNG est un réactif dédié qui élimine l'étape d'extraction et de purification des acides nucléiques à partir des échantillons, permettant la détection quantitative par fluorescence en une seule étape (méthode basée sur une sonde) des gènes cibles. Grâce à son excellente tolérance aux inhibiteurs, ce réactif permet l'amplification et la détection directes en une seule étape par RT-PCR d'échantillons de sang total anticoagulé, de plasma, de sérum, d'écouvillons de gorge, de salive et autres, sans extraction ni purification préalable des acides nucléiques. Formulé avec l'enzyme TS-UNG et un système tampon optimisé contenant du dUTP, il prévient efficacement les faux positifs dus aux résidus de produits PCR et à la contamination par aérosols.
Composants
1. 25×RobuDirect RTase/UNG Mix-0225
2. Tampon de prémélange 2×RobuDirect RT (dUTP) -0225
Stockage
Conserver à -20±5℃; bien mélanger avant utilisation et éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
Instructions
1. Préparation du système de réaction qRT-PCR
| Composants | Volume de 25 µL | Volume de 50 µL | Concentration finale |
| 2×RobuDirect RT Premix Buffer (dUTP) -0225 | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 25×RobuDirect RTase/UNG Mix-0225 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mélange amorce-sonde 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN matrice** | —— | —— | —— |
| ddH2LE | À 25 µL | À 50 µL | —— |
En général, une concentration finale d'amorce de 0,2 μM donne des résultats optimaux ; si la réaction est peu performante, la concentration d'amorce peut être ajustée entre 0,2 et 1 μM. La concentration de sonde est généralement optimale entre 0,1 et 0,3 μM. Il est recommandé de réaliser une expérience de gradient de concentration afin de déterminer la combinaison optimale d'amorce et de sonde.
Les différents types d'échantillons biologiques présentent des variations quant au type et à la concentration d'inhibiteurs, ainsi qu'au nombre de copies des gènes cibles ; l'impact des différentes solutions de conservation (par exemple, la solution de conservation des écouvillons) sur la réaction d'amplification est également variable. Par conséquent, le volume optimal d'échantillon dans le système de réaction doit être déterminé en fonction des conditions réelles, telles que le type d'échantillon et la sensibilité de détection requise. Si nécessaire, l'échantillon peut être dilué avec de l'eau sans nucléase ou du tampon TE avant d'être chargé. Les volumes d'échantillon recommandés sont les suivants :
| Type d'échantillon | Ajout de 50 µL de système réactionnel | Rapport d'échantillonnage maximal |
| AWB | 2,5 µL | 5% |
| Plasma | 10 µL | 30% |
| Sérum | 10 µL | 30% |
| écouvillon de gorge | 10 µL | 20% |
| Salive | 10 µL | 20% |
2. Programme de réaction
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50℃ | 10-20 min | 1 |
| Prédénaturation | 95℃ | 1 à 5 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10-20 s | 40-50 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 20-60 s |
* L'enzyme TS-UNG thermosensible contenue dans ce produit peut effectuer la digestion à température ambiante et devenir inactive pendant le processus de transcription inverse.
Contrôle de qualité
1. Détection fonctionnelle : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qRT-PCR.
2. Absence d'activité nucléasique exogène : absence de pollution par des endonucléases et des exonucléases exogènes.
Informations techniques
Ce système utilise généralement une température de 50 °C pour la transcription inverse, mais celle-ci peut être optimisée entre 42 °C et 55 °C. Selon les caractéristiques de la réaction, la durée de la transcription inverse peut être optimisée entre 5 et 30 minutes. Il est adapté aux réactions de RT-PCR quantitative multiplex.
2. En cas de problèmes tels qu'une fluorescence trop faible ou une inhibition significative de l'amplification, il est recommandé de réduire le volume de l'échantillon ou de le diluer avant son ajout. Il est également possible, à volume d'échantillon constant, d'améliorer la situation en augmentant le volume réactionnel (60-100 µL).
3. Les prélèvements de sang, de salive et d'écouvillons de gorge doivent être effectués conformément aux procédures opératoires cliniques standard. Afin d'éviter la dégradation des acides nucléiques, il est possible d'utiliser des échantillons fraîchement prélevés.
4. Pour les amorces avec des températures d'hybridation basses ou l'amplification de fragments de plus de 200 pb, une méthode en trois étapes est recommandée.
5. L'efficacité d'utilisation du dUTP et la sensibilité aux enzymes UNG varient selon les gènes à amplifier. Par conséquent, si l'utilisation du système UNG entraîne une diminution de la sensibilité de détection, le système de réaction doit être ajusté et optimisé. Veuillez contacter notre société pour obtenir une assistance technique.
6. Veuillez utiliser des zones et des pipettes dédiées avant et après l'amplification, porter des gants pendant la manipulation et les changer fréquemment. Ne pas ouvrir le tube de réaction après la fin de la réaction PCR afin de minimiser la contamination de l'échantillon par le produit de PCR.
7. Réservé à la recherche !