Kit maître d'isolement d'ARNm NGS V2 HYD217
Le kit NGS mRNA Isolation Master Kit V2 est une version améliorée du kit de billes magnétiques conçu spécifiquement pour la purification de l'ARNm. Les billes de capture d'ARNm sont des microsphères paramagnétiques de taille micrométrique conjuguées à l'oligo(dT). Elles se lient à l'ARNm portant une queue poly(A) pour séparer et purifier l'ARNm, de 10 ng à 4 µg d'ARN total, en préservant son intégrité.
Composants
| Composants | 24 T | 96 T |
| Billes de capture d'ARNm 2.0 | 1,2 mL | 4,8 mL |
| Tampon de liaison de perles 2.0 | 1,2 mL | 4,8 mL |
| Tampon de lavage de perles 2.0 | 15 mL | 60 mL |
| Tampon Tris 2.0 | 1,2 mL | 4,8 mL |
| Eau sans nucléase | 1 mL | 4 mL |
Stockage
À conserver entre 2 et 8 °C pendant 1 an.
Instructions
1. Préparation avant l'expérience
Sortez les billes de capture d'ARNm 2.0 de leurs conditions de stockage à 2~-8℃ et laissez-les reposer pour s'équilibrer à température ambiante (environ 30 minutes).
2. Préparation des échantillons
Dans un tube PCR sans nucléase, diluer 10 ng à 4 μg d'ARN total dans un volume de 50 μL avec de l'eau sans nucléase. Placer le tube sur glace.
3. Liaison de l'ARNm aux billes magnétiques
1. Retournez ou vortexez les billes magnétiques pour les mélanger uniformément. Prélevez 50 μL de billes de capture d'ARNm 2.0 et ajoutez-les aux 50 μL d'échantillon d'ARN total. Pipettez 6 fois pour assurer un mélange homogène.
2. Placez le mélange de billes magnétiques et d'ARN dans un appareil PCR et réglez les conditions suivantes : 65 °C pendant 5 minutes ; 25 °C pendant 5 minutes ; puis maintenez à 25 °C pour achever la liaison de l'ARN aux billes magnétiques de capture.
3. Déposez l'échantillon sur un support magnétique et laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 minutes afin de séparer l'ARNm de l'ARN total. Retirez délicatement le surnageant.
4. Lavage de l'échantillon
1. Retirez l'échantillon du support magnétique, ajoutez 200 μL de tampon de lavage de billes 2.0 pour remettre les billes magnétiques en suspension, et pipetez de haut en bas 6 fois pour bien mélanger.
2. Déposez l'échantillon sur le support magnétique et laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 minutes. Retirez délicatement le surnageant.
3. Répétez l'étape précédente pour un total de deux lavages.
5. Élution de première étape de l'échantillon d'ARNm
1. Retirez l'échantillon du support magnétique, ajoutez 50 μL de tampon Tris 2.0 pour remettre en suspension les billes magnétiques et pipetez de haut en bas 6 fois pour bien mélanger.
2. Placez l'échantillon dans un appareil PCR et réglez les conditions comme suit : 80 °C pendant 2 minutes, puis maintenez à 25 °C pour éluer l'ARNm.
6. Liaison de l'ARNm aux billes magnétiques
1. Retirez l'échantillon de l'instrument PCR, ajoutez 50 μL de tampon de liaison aux billes 2.0 et pipetez de haut en bas 6 fois pour bien mélanger.
2. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre à l'ARNm de se lier aux billes magnétiques.
3. Déposez l'échantillon sur le support magnétique et laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 minutes. Retirez délicatement le surnageant.
7. Lavage de l'échantillon
Retirez l'échantillon du support magnétique, ajoutez 200 μL de tampon de lavage de billes 2.0 pour remettre les billes magnétiques en suspension, pipetez de haut en bas 6 fois pour bien mélanger, puis replacez l'échantillon sur le support magnétique, laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 minutes, puis aspirez tout le surnageant.
Remarque : Enfin, utilisez une pipette de 10 μL pour aspirer complètement le liquide résiduel.
8. Sélectionner la méthode de traitement en fonction du processus expérimental suivant
a. Si le produit purifié est utilisé pour une réaction de transcription inverse, retirez l'échantillon du support magnétique, ajoutez 10,5 μL d'eau sans nucléase, pipetez 6 fois pour bien mélanger, chauffez à 80 °C pendant 2 minutes, puis replacez immédiatement sur le support magnétique pendant 5 minutes. Une fois la solution limpide, prélevez délicatement 8,5 μL du surnageant et transférez-les dans un nouveau tube PCR sans nucléase.
b. Si le produit purifié est utilisé pour la construction d'une bibliothèque d'ARN, ajoutez le volume correspondant de tampon Frag/Prime conformément au manuel d'instructions et procédez à la construction de la bibliothèque.
Notes
1. Avant d'utiliser des billes magnétiques, il est essentiel de les laisser revenir à température ambiante et de les mélanger. Sinon, cela pourrait affecter l'efficacité de récupération des échantillons.
2. Au cours de l'opération, il est impératif de s'assurer strictement de l'absence de RNase et d'acide nucléique.
3. Lorsque ce produit est utilisé en combinaison avec d'autres réactifs, veuillez suivre les instructions expérimentales spécifiques.
4. Pour obtenir un bon effet de purification, il est nécessaire d'avoir un ARN total avec une bonne intégrité et de s'assurer que la valeur RIN (RNA Integrity Number) est de 7,0 ou plus.
5. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables lors de l'utilisation.
6. Ce produit est uniquement destiné à la recherche !