Kit de déplétion d'ARNr NGS (ARNr et ITS/ETS) HYD218
Ce kit utilise la digestion par la RNase H pour éliminer l'ARN ribosomique et les régions ITS/ETS 45S de l'ARN total humain, murin et de rat, afin de préserver l'ARN messager (ARNm) et les autres ARN non codants. Ce kit est efficace pour l'élimination de l'ARNr, aussi bien pour l'ARN total intact que pour l'ARN total partiellement dégradé (comme l'ARN FFPE). Les échantillons FFPE dégradés contenant généralement une proportion plus élevée de régions ITS/ETS que les échantillons de tissus frais, les sondes ciblant la région ITS/ETS 45S humaine, murine et de rat incluses dans ce kit permettent d'augmenter significativement la proportion de données valides dans les résultats de séquençage après élimination de ces régions.
Composants
| Composants | 24 T | 96 T |
| Tampon d'hybridation | 72 μL | 288 μL |
| Mélange de sondes humaines (ARNr et ITS/ETS) | 48 μL | 192 μL |
| Tampon RNase H | 72 μL | 288 mL |
| RNase H | 48 μL | 192 mL |
| Tampon DNase I | 660 μL | 2×1320 μL |
| DNase I | 60 μL | 240 μL |
Stockage
À conserver à -25~-15℃ pendant 1 an.
Instructions
1. Hybridation de la sonde
1. Sortez la sonde et le tampon d'hybridation de -20 °C, décongelez-les, retournez-les et mélangez-les, puis placez-les sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
2. Préparation de l'échantillon d'ARN : Calculer le volume d'ARN à prélever en fonction de la quantité initiale et de la concentration de l'échantillon, puis diluer à 10 µL avec de l'H2O sans nucléase2
3. Préparer le système de réaction d'élimination de l'ARNr dans un tube PCR de 200 μL selon le tableau 1.
Tableau 1 Système de réaction d'hybridation de la sonde
| Composants | Volume |
| Tampon d'hybridation | 3 μL |
| Mélange de sondes humaines (ARNr et ITS/ETS) | 2 μL |
| ARN total | 10 (100 ng~1 μg) |
| RNase H | 48 μL |
| Tampon DNase I | 660 μL |
| DNase I | 60 μL |
4. Utilisez une pipette pour souffler doucement et mélanger, puis centrifugez la solution réactionnelle jusqu'au fond du tube.
5. Placez le tube PCR ci-dessus dans l'instrument PCR et effectuez la réaction d'hybridation de la sonde selon le programme de réaction indiqué dans le tableau 2.
Tableau 2 Programme de réaction d'hybridation de la sonde
| Température | Temps |
| Chauffer le couvercle à 105°C | Sur |
| 95°C | 2 min |
| 95°C-22°C | 0,1°C/s |
| 22°C | 5 min |
| 4°C | prise |
2. Digestion par la RNase H
1. Sortez le réactif de digestion de la RNase H de -20 °C, décongelez-le, retournez-le et mélangez-le, puis placez-le sur de la glace pour une utilisation ultérieure. Préparez le système réactionnel de digestion de la RNase H comme indiqué dans le tableau 3.
Tableau 3 Système de réaction de digestion par la RNase H
| Composants | Volume |
| Tampon RNase H | 3 μL |
| RNase H | 2 μL |
| Produit de l'étape précédente | 15 μL |
Remarque : Le tampon RNase H et la RNase H doivent être ajoutés séparément. Si vous devez préparer un mélange en raison d’un grand nombre d’échantillons, veuillez le faire juste avant utilisation, sinon l’efficacité de l’élimination sera compromise.
2. Utilisez une pipette pour souffler doucement et mélanger, puis centrifugez la solution réactionnelle jusqu'au fond du tube.
3. Placez le tube PCR ci-dessus dans l'instrument PCR et réglez le programme de réaction : couvercle chauffant 50 °C ; 37 °C, 30 min ; 4 °C, maintien, et effectuez la réaction de digestion à la RNase H.
3. Digestion par la DNase I
1. Sortez le réactif de digestion à la DNase I de -20 °C, décongelez-le, mélangez-le par retournement et placez-le sur de la glace pour une utilisation ultérieure. Préparez le système réactionnel de digestion à la DNase I comme indiqué dans le tableau 4.
Tableau 4 Système de réaction de digestion à la DNase I
| Composants | Volume |
| Tampon DNase I | 27,5 μL |
| DNase I | 2,5 μL |
| Produit de l'étape précédente | 20 μL |
2. Utilisez une pipette pour pipeter délicatement afin de mélanger, puis centrifugez la solution réactionnelle jusqu'au fond du tube.
3. Placez le tube PCR ci-dessus dans un instrument PCR et réglez le programme de réaction : couvercle chauffant 50 °C ; 37 °C, 30 min ; 4 °C, maintien, et effectuez la réaction de digestion à la DNase I.
4. Purification de l'ARN
1. Préparation : Sortez les billes magnétiques NGS RNA Cleaner du réfrigérateur et laissez-les s'équilibrer à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Préparez une solution d'éthanol à 80 % sans nucléase.2
2. Vortexez ou inversez les billes magnétiques pour assurer un mélange homogène.
3. Pipettez 110 μL de nettoyant NGSRNA (2,2×, billes : ADN = 2,2 : 1) dans le produit de l'étape précédente, pipettez pour bien mélanger et incubez à température ambiante pendant 5 min.
4. Placez le tube PCR dans un support magnétique pour séparer les billes magnétiques du liquide. Une fois la solution limpide (environ 3 min), retirez délicatement le surnageant.
5. Placez le tube PCR dans le support magnétique, ajoutez 200 μL d'éthanol à 80 % fraîchement préparé pour laver le support magnétique, incubez à température ambiante pendant 30 secondes et retirez soigneusement le surnageant.
6. Répétez l'étape 5) pour un total de deux rinçages. Utilisez une pipette de 10 μL pour aspirer le liquide restant.
7. Gardez le tube PCR dans le support magnétique et ouvrez le couvercle pour sécher les billes magnétiques à température ambiante (5 à 10 min).
8. Élution de l'ARN : Retirer le tube PCR du support magnétique, ajouter 11 µL d'H sans nucléase2O (ou utiliser le volume correspondant de H exempt de nucléases)2O ou tampon d'élution adapté aux expériences en aval), utiliser une pipette pour souffler doucement jusqu'à ce que le mélange soit complet, et laisser reposer à température ambiante pendant 5 min.
9. Centrifugez brièvement le tube PCR et placez-le sur un support magnétique. Une fois la solution limpide (environ 3 min), transférez délicatement 10 μL de surnageant (à ajuster selon le volume d'élution choisi à l'étape 7) dans un nouveau tube PCR sans nucléase.
Remarque : Veuillez effectuer immédiatement les expériences en aval sur les échantillons élués ou les conserver à -80 °C.
Notes
1. Veuillez utiliser des consommables sans RNase et nettoyer régulièrement la zone expérimentale. L'utilisation du kit RNAZap de Thermo Fisher est recommandée.MCSpray à haute efficacité pour l'élimination des acides nucléiques et la suppression de la contamination par la RNase.
2. Les échantillons d'ARN ne doivent pas contenir de contamination par de l'ADN génomique. En cas de présence de résidus d'ADN génomique, ceux-ci doivent être digérés et purifiés par la DNase I avant utilisation de ce kit.
3. Le volume maximal d'échantillon d'ARN à introduire est de 10 μL. Si le volume de l'échantillon est important, il peut être concentré au préalable.
4. Si l'étape de digestion à la RNase H doit être utilisée avec le mélange, veuillez la préparer maintenant ; il y aura un surplus dans les spécifications 24 T de ce composant.
5. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables lors de l'utilisation.
6. Ce produit est destiné uniquement à la recherche scientifique !