Kit RT-qPCR SYBR Green One Step HYA417
Le kit One Step SYBR Green RT-qPCR est un kit spécifique pour la réaction RT-qPCR en une seule étape utilisant la fluorescence chimérique SYBR Green I. Ce kit utilise l'ARN comme matrice, des amorces spécifiques du gène, et permet de réaliser la transcription inverse et la PCR en continu dans le même tube, sans ouverture ni pipetage supplémentaires. Ceci améliore considérablement le débit de détection et prévient efficacement toute contamination. Ce système de réaction permet la détection en temps réel des produits d'amplification, améliorant ainsi la sensibilité de détection et supprimant l'étape d'électrophorèse après la PCR. Il est particulièrement adapté à la détection des virus à ARN et d'autres traces d'ARN. Ce produit combine les avantages de la transcriptase inverse et de la Taq ADN polymérase, associés à un système tampon optimisé, pour une efficacité et une spécificité d'amplification élevées, garantissant une réaction RT-qPCR en une seule étape stable. De plus, tous les enzymes nécessaires à la réaction sont regroupés dans un mélange enzymatique, pour une utilisation plus simple et plus pratique.
Composants
| Composants | 25T | 250T |
| Tampon RT-qPCR SYBR Green One Step 2X* | 250 μL | 2 × 1,25 mL |
| Mélange enzymatique en une étape** | 20 μL | 200 μL |
| Colorant de référence ROX 50X I *** | 10 μL | 100 μL |
| Colorant de référence ROX 50X II *** | 10 μL | 100 μL |
| eau ddH2O sans RNase | 1,25 mL | 2 × 1,25 mL |
*Contient des dNTP, du Mg2+, SYBR Green I, etc.
** Contient de la transcriptase inverse, un inhibiteur de RNase et de la Taq ADN polymérase.
*** À utiliser pour corriger l'erreur du signal de fluorescence entre les trous
Stockage
Ce produit doit être conservé à -20℃ pour un stockage à long terme et doit être protégé de la lumière.
Instruments
| Types de Rox | Machines qPCR |
| Pas de ROX | Bio-Rad iCycler, Roche LightCycler, Qiagen/Corbett et autres |
| Colorant de référence ROX I | ABI 7000/7300/7700/7900, ABI StepOne/StepOnePlus, Eppendorf et autres |
| Colorant de référence ROX II | ABI 7500, ABI ViiATM7, ABI QuantaStudio, Stratagene, Corbett Rotor Gene 3000 et autres |
Remarque : La concentration du colorant de référence ROX varie selon les instruments. Pour savoir s’il faut l’ajouter ou non, veuillez vous référer aux modèles ci-dessus.
Notes
1. Lors de l'utilisation du tampon RT-qPCR SYBR Green One Step 2X, veuillez le faire fondre complètement, bien mélanger avant utilisation. Conserver à l'abri de la lumière et de la lumière directe du soleil. Si plusieurs réactions RT-qPCR One Step doivent être préparées simultanément, il est recommandé de préparer un prémélange de tous les réactifs, à l'exception des amorces et des matrices, puis de le répartir dans chaque tube de réaction afin de limiter les pertes de réactifs.
2. Le mélange enzymatique One Step inclus dans le kit contient une forte concentration de glycérol. Avant utilisation, veuillez mélanger délicatement en évitant la formation de mousse. Utiliser immédiatement après centrifugation. Après utilisation, conserver au réfrigérateur à -20 °C.
3. La configuration et le chargement fractionné du liquide de réaction doivent utiliser une lance non polluante et un microtube pour éviter autant que possible la contamination.
4. Pour assurer le succès de la réaction, il est recommandé d'utiliser des matrices d'ARN de haute qualité.
5. Ce kit ne peut utiliser que des amorces spécifiques et ne peut pas utiliser d'amorces aléatoires ni d'amorces Oligo dT pour la réaction de transcription inverse. Lors de la conception d'une expérience RT-qPCR en une étape pour l'amplification des amorces, une longueur de produit recommandée de 70 à 200 pb donne les meilleurs résultats.
Instructions
1. qRT-PCR RréactionSystème
| Composants | 20uLVolume | 50uLVolume |
| Tampon RT-qPCR SYBR Green 2X One Step | 10 µL | 25 µL |
| Mélange enzymatique en une étape | 0,8 µL | 2 μL |
| Amorce sens (10 μM) * | 0,4 µL | 1 μL |
| Amorce inverse (10 μM)* | 0,4 µL | 1 μL |
| Colorant de référence ROX 50X ** | 0,4 µL | 1 μL |
| ARN matrice *** | 2 μL | 5 μL |
| H sans nucléase2LE | Jusqu'à 20 µL | Jusqu'à 50 µL |
La concentration finale d'amorce est généralement de 0,2 μM, ce qui permet d'obtenir de meilleurs résultats. Si la réaction est peu performante, la concentration d'amorce peut être ajustée entre 0,1 et 1,0 μM. La longueur du produit d'amplification est recommandée dans la plage suivante :
70-200 bp.
**Sélectionnez la teinture ROX appropriée en fonction du modèle applicable.
*** Il est recommandé d'introduire 50 pg~300 ng d'ARN total comme matrice dans un système de 20 μL.
2. RT-qPCR Rréaction Programme
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 42℃ | 5 min | 1 |
| Prédénaturation | 95 °C | 1 min | 1 |
| Réaction circulaire | 95℃ | 5 s | 40 |
| 60℃ | 30-34 s * | ||
| Courbe de fusion | Par défaut de l'instrument | - | 1 |
* Veuillez ajuster le temps d'extension en fonction du temps minimum de collecte de données requis par votre appareil de PCR en temps réel : réglez-le sur 30 s avec le StepOnePlus ; réglez-le sur 31 s avec le 7300 ; réglez-le sur 34 s avec le 7500.
Confirmer la courbe d'amplification et la courbe de fusion après la réaction, établir la courbe standard.